Способ проведения гибридизационного анализа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/543 C12Q1/68 

СП

С

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам проведения гиб- ридизационного анализа, и может быть использовано ДАЯ поиска, идентификации и детекции уникальных последовательностей в нуклеиновых кислотах. Целью изобрете- ния является повышение чувствительности анализа и упрощение способа. Способ проведен, л гибридизационного анализа включает иммобилизацию исследуемой нуклеиновой кислоты на синтетической мембране и гибридизацию ее со специфическим зондом, несущим биоспецифический лиганд. Образовавшиеся гибриды детектируют с помощью коньюгата окрашенных ла- текстных частиц,содержащих 0,001-0,5 мзс.% красителя, с лигандсвязывающим белком. С помощью предлагаемого способа можно проводить множественный гибридизацион- ный анализ нуклеиновых кислот ,1 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам проведения гибридизационного анализа, и может быть использовано для поиска, идентификации и детекции различных нуклеотидных последовательностей в нуклеиновых кислотах.

Цель изобретения - повышение чувствительности анализа и упрощение способа его проведения.

Способ проведения гибридизационного анализа включает иммобилизацию исследуемой нуклеиновой кислоты на синтетической мембране, гибридизацию ее со специфическим- зондом, несущим биоспецифический лиганд (метку), и детекцию образовавшихся гибридов с помощью коньюгата окрашенных лзтексных частиц, содержащих 0,001-0,5 мас.% красителя, с лигандсаязывающим белком.

Нуклеиновая кислота при иммобилизации на пористой синтетической основе адсорбируется как на поверхности мембраны, так и в ее порах (особенно для нейлоновых мембран). При проведении детекции с помощью ДНК-зондов, связанных с молекулами красителя или с коллиодным золотом, последние попадают в поры мембраны и там связываются с определяемыми нуклеиновыми кислотами. При реализации предлагаемого способа для проведения гибридизационного анализа используют конъюгат латексных частиц с лигандсвязывающим белком с размерами частиц 0,2- 5 мкм, которые не проникают в поры мембраны. Несмотря на это сохраняется стабильность образовавшихся гибридов и повышается чувствительность анализа.

При использовании в качестве окрашивающего агента латексных частиц, содержаО

ю о ю со

00

v,

ч

щих менее 0,001 мас.% красителя, образовавшиеся гибриды прокрашиваются слабо и чувствительность анализа снижается. Использование латексных частиц, содержащих более 0,5 мас.% красители, приводит к потере стабильности конъюгата, что обусловливает появление более высокого фонз, сопоставимого с сигналом.

Способ более эффективен, так как позволяет проводить множественный гибрм- дизационный анализ, т.е. одновременную детекцию нескольких гибридов.

Для этого перед проведением гибридизации проводят мечение нескольких зондов нуклеиновых кислот индивидуальными биоспецифическими лигандамм (биотаном, ran- тенами, антигенами), которые вводят в гибридизацию одновременно. После завершения гибридизации и отмывки от избытков зондов s раствор одновременно вводят конь- югаты латексоз с соответствующими лмганд- связывающими белками (сдрептавидином, ферментом, антителами). Одновременное использование по данному способу нескольких окрашенных латексов, несущих флуоресцирующие в различных областях спектра красители, дает возможность визуально лпм с использованием УФ-ламп v, оптических фильтров, а также спектрофлуориметров проводить анализ одновременно нескольких участков исследуемой нуклеиновой кислоты за счет одновременной идентификации нескольких образовавшихся гибридов.

Пример 1. а) Поиготовление конъюгата латекса, содержащего пиронин Ж со стрептавидимом.

К 1 мл 5% - ной суспензии полиакролеино- вого (ПА) латекса в 0,1 М ФСБ, рН 7,2, наполненного красителем гшронин Ж (0,1 %), с размерами частиц 4,8 мкм добавляют 250 мкг стрептавидина в 2 мл того же буфера.Смесь выдерживают 3 ч при комнатной температуре. Полученный конъюгат трижды промывают на центрифуге 0,1 М ФСБ, рН 7,2, содержащим-0,5% овальбуми- на, редиспергируют в том же буфере до 0,1%-ной концентрации и хранят при 4°С

б) Иммобилизация ДНК на нейлоновый фильтр.

0,1 мл раствора ДНК фага А в воде (5 мкг/мл) денатурируют в течение 5 мин при 100°С, быстро охлаждают во льду и готовят серию разведений, уменьшая концентрацию ДНК при каждом разведении в 5 раз. По 1 мкл полученных растворов ДНК наносят на нейлоновый фильтр, который предварительно вымочен в течение 30 мин в 0,4 М трис-НС -буфере с рН 7,5, а затем высушен на воздухе, s количествах 1 нг.

200 пг,40 пг,8 пг, 1,6 пг. Ппоидадь пятна с иммобилизованной ДНК составляет 4 мм2. в) Мечение ДНК-зочда биотипом. 0,1 мл раствора ДНК фага Я в воде

(1 мг/мл) инкубируют при 95°С в течение 10 мин. После этого с раствору ДНК добавляют 200 мкл раствора, содержащего 1,6 М бисульфит натрия и 3,6 М этилендиамин, доведенный до рН 7,5 уксусной кислотой и

0 прогретого при 95°С в течение 10 мин. Смесь инкубируют при 95°С 30 мин, после чего ресь раствор (0,3 г/л}, содержащий ДНК, наносят на колонку и ДНК отделяю: гель- фильтрацией на сефадексеб-50 (Superfine),

5 используя для злюции 0,1 М нзтрийборат- ный буфер, рН 8,5. К фракциям, содержащим ДНК (объемом 0,7 мл), добавпяют 100 мкл оаствора N-оксисукцииммидного эфира в диметилформамиде (концентрация

0 50 мкмоль/мл) и инкубируют в течение 10 ч, От избытка биотинилирующего агента ДНК отделяют из колонке, содержащей сефгдекс G-50 Superfine) в 0,15 Ы NsCi. Раствор би- отантированной ДНК хранят при -2С°С.

5 ) Гибридизация.

Нзйлоновые ,ы с нанесеннай на них jHK переносят в «амжи Петри с 3 мл прс,1г-/1бридизационного раствора (1 мл на 1 см2), содержащего (sa 10 мл) 2 мл воды,

0 5 мл формзмида, 1 мл 10%-ного додецил- сульФвта натрия (ДСН) 2 мл 50%-ного де- кстраисульфата, 0,5 мл М трис-НС, рН 7,5, к 0,5В г Nad. Инкубируют 10 мин при 42°С. Зате добавляют 120 мкг (из расчета

5 40 мкг/мл) ДНК спермы лосося и 0,6 мкг биогинилмрозаниой ДНК (из расчета 0,2 мг.г/мл), которые предварительно денатурируют 10 мин при 100°С. Гибридизацию врдут при 42°С в течение 16 ч при

0 постоянном перемешивании. По окончании гибридизации фильтры отмывают два раза по 5 мин раствором (3 мл), содержащим 0,3 М NaCI и 0,4 М цитрат натрия, при комнатной температуре, два раза по 30 мин в

5 3 мл раствора, содержащего 0,3 М NaC, 0,04 М цитрат натрия v 1 %-ный ДСЧ, при 42°С, два раза по 10 мин раствором, содержащим 0,015 М NaC и 0,002 М иртрат натрия, при комнатной температуре.

0 После отмывки фильтр можно либо хранить, либо сразу использовать для детекции.

д) детекция образовавшегося брузда .ДНК.

5 Отмытые фильтры вымачивают ь растворе, содержащем 0,1 М трис-HCI. рН 7,5; 0,1 М NaCI, 0,05%-ный тритон Х-100 TST) и 1 %-ный желатин, в течение 10 ин. Затем в указанный растэоо добавчяют суспензию конъюгата латекса, наполненного пиронином Ж, из расчета 0,01% на 1 мл раствора. Через 20 мин пссле начала инкубации на качалке при комнатной температуре наблюдают появление окрашенных (при видимом свете обнаруживается 200 пг ДНК) м флуоресцирующих При УФ-ОблучегтИИ (365 НМ)

пятен. Наибольшая чувствительность достигается через 1 ч инкубации и состочлчет 1,6 пг или 0,4 пг/мм2.

Пример 2. а) Приготовление коныс- гата латекса, содержащего флуоресцеик ее стрептяБ идином.

К 1 мл 5%-ной суспензии ПА-латекса в 0,1 М ФСБ, рН 7,4, окрашенного красителем флуоресцеин (0,5%), с размером частиц 0,20 мкм добавляют 350 мкг стрсптар -.дича в 2 мл того же буфера, Далее проиесг. ведут аналогично описанному в примерз 1,

б)Иммобилизация ДНК на нитроцеллю- лозном фильтре.

Нитроцеллюпозные фильтры предварительно вымачивают 2 мин в воде к згте 10 мин в растворе, содержащем 0,9 NaC п 0,12 М цитрат натрия. Подготовка проГ ДНК и нанесение их на высушенные фильтры аналогичны примеру 1. После этого фильтзы запекают з течение 2 ч при 80°С.

в)Мечение ДНК-зонда биотипом -- как в примере 1.

г)Гибридизация.

Нитроцеллюлоз ные фильтры с нанесенной на них ДНК переносят о чашки Петри с предгибридизационным раствором на 1 ч в буфере, содержащем 1 мл раствора Денхар- дта (состав, г; фикол 5: поливчнилпирроли- дон 5; бычий сывороточный альбумин (БСА) 5; вода до 500 мл), 1 мл раствора, содержащего 3 М NaCI, 0,2 М ЭДТА. воду. 0,6 М трмс-HCi, доведенный НС до рН 8,0, 50 мкл 10%-ного ДСП, 3 мл воды, 15 мкл дрожжевой т-РНК (концентрация 10 мг/мл) на 5 мл раствора. Затем добавляют 0,6 мкгбиотини- лированной ДНК (из расчета 0,2 мкг/мл), которую предварительно денатурируют 10 мин при 100°С, к раствору, содержащему на 5 мл 2,5 мл формамида, 0,2 мл раствора Денхардта, 1 мл раствора, содержащего 3 М №Ci, 0,2 М ЭДТА, воду, 0,5 М трис-HCI, доведенный НС до рН 3,0, 15 мкл дрожжевой т-РНК. 1,235мл водь1, 50 мкл 10,%-ного ДСН. Гибридизацию проводят 3 ч. По окончании гибридизации фильтры отмывают аналогично примеру 1.

д)Детекция образовавшегося гибрида ДНК,

Отмытые нмтроцеллюлозные фильтры вымачивают в 3 мл раствора 1ST и 1 %-ного желатина в течение 15 мин. Затем в указанный раствор добавляют суспензию конью- гата латекса, содержащего 0,03%

флуоресцеина из расчета 0,1% на 1 мл pdc- твора. Через 20 мин после начала инкубации на качалке при комнатной температуре наблюдается поязпечие окрашенных (при

5 видимом свете обнаруживается 0,1 нг ДНК) и флуоресцирующих пятен при УФ-облуче- нии пятен, Наибольшая чувствительность получена через 2 ч инкубации и составляет 4пг ДНК(1 пг/мм2).

10 П р и м & р 3, а) Прнготовпение кслъю- гата , содержащего акридиновый

Орйг Ж9ВЫЙ С ЗВИДИНОМ.

К 1 г.;л 5%-н-ой суепочзии ПА-латекса в 0,05 М ОС5, рН 7,2, содержащего краситель 15 акридиновый орвнжевый в количестве л 001 %.сряз,чэро.ччастиц 1,2 икм добавляют 300 мкг ЗВМДУЖЗ в 2 мл того же буфера. Далее процесс веду аналогично примеру 1.

б)Мммобилизаци ДНК на нейлоновом 0 фильтре - клк в примере 1.

в)Мечение ДНЧ-эонда бмотином - как в псимаре ;

г)П. о дизаь;ип - как е примере 1.

д)Детеки обргзссзашегося гибоида 5 ДНК.

Отмету е нейлоновые фильтры вымачивают в 3 мл ргстворе TST с 1 %-ным желатином и 0%-ной сахарозой з течение 10 мин. Затем в указанный раствор добавляют сус0 пензию коньюгата латекса, окрашенного акридиновым оранжевым с авидинсм из расчета 0,001% из 1 мл оастеорз. Через 30 мин после начата продления на качалке пр комнатной температуре наблюдается

L пояаление окрашенных (при видимом сзете обнаружено 0,2 нг ДНК) и флуоресцирующих при УФ-облучзнии пятен. Наибольшую чувствительность получают через 4 ч после начала инкубации, она составляет 4 пг или

0 1 пг/мм2.

Формула изобретения 1. Способ проведения гибридизацион- ного анализа, включающий иммобилиза5 иию исследуемой нуклеиновой кислоты на синтетической мембране,гибридизацию нуклеиновой кислоты со специфическим зондом, несущий биоспецифическиГ ли- ганд, t.; визуализацию образовавшихся

0 гибридов с помощью кокъюгата окрашивающего агента с лигандсзязывающим бел- ком,о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с иелью повышения чувствительности анализа и упрощения способа его проведения, в ка5 честве окрашивающего агента используют латекс-ные частицы, содержащие 0,001-0,5 мае. % красителя.

менного анализа нескольких участков ис-ализацию образовавшихся гибридов провоследуемой нуклеиновой кислоты, послед-дят при обработке суспензией, содержащей

нюю гибридизуют одновременно снесколько конъюгатов различно окрашеннесколькими специфическими зондами, не-ных латексов с соответствующими лигандсущими биоспецифические лиганды, а визу-5 связывающими белками.