СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕРАДИОАКТИВНОМЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Российский патент 1995 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии, медицине и ветеринарии и может быть использовано для детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот (НК) методом молекулярной гибридизации для диагностики наследственных и бактериальных заболеваний человека и животных.

Синтез и использование нерадиоактивномеченных гибридизационных зондов является актуальной задачей в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве. Применение в широкой практике гибридизационных тестов на заражение человека, животных, растений различными микроорганизмами сдерживается отсутствием недорогих, технологичных и не использующих радионуклиды способов приготовления зондов.

Известен способ получения нерадиоактивных зондов, основанный на реакции расширения одноцепочечного разрыва в ДНК с помощью ферментов (ник-трансляция) [1] Способ включает следующие стадии: внесение в ДНК-матрицу одноцепочечных разрядов с помощью фермента ДНК-азы 1; тепловая инактивация фермента ДНК-азы 1; полимеризация дезоксинуклеозидтрифосфатов на матрице ДНК с помощью ДНК-полимеразы 1, причем один из предшественников мечен радиоактивно, а второй несет нерадиоактивную метку; контроль по радиоактивной метке за процессом полимеризации; очистка меченной ДНК от ферментов и невключившихся предшественников.

Недостатками способа являются использование ферментов и дорогостоящих предшественников, необходимость контролирования процедуры полимеризации, малое количество одновременно обрабатываемой ДНК (не более 5 мкг), чувствительность ферментов к качеству ДНК-матрицы, возможность мечения лишь двуцепочечных дезоксиполинуклеотидов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения нерадиоактивных зондов, основанный на реакции двуцепочечной ДНК с дигидразидом янтарной кислоты [2] включающий следующие стадии: тепловую денатурацию ДНК при 95^оС в течение 5 мин; инкубацию денатурированной ДНК с равным объемом дигидразида янтарной кислоты pH 5 при 95^оС в течение 15-60 мин; выделение модифицированной ДНК гель-фильтрацией на Sephadex G-50; концентрирование образца; мечение модифицированной ДНК N-гидроксисукцинимидным эфиром D-биотинил-ε-аминокапроновой кислоты; очистку меченой ДНК от неприсоединившегося биотина на Sephadex G-50.

Недостаток данного способа жесткие условия модификации ДНК (длительная инкубация при 95^оС, pH 5), приводящие к падению качества зонда. При чувствительности в гибридизации 20 пг резко сужается область применения таких зондов. Описано применение данного способа для мечения лишь двуцепочечных дезоксиполинуклеотидов.

Технической задачей изобретения является повышение качества целевого продукта (увеличение чувствительности при выявлении зонда, расширение круга модифицируемых НК (одно- и двуцепочечные поли- и олигонуклеотиды, дезокси- и рибо- производные), увеличение стабильности получающегося продукта).

Поставленная задача достигается тем, что в качестве переаминирующего агента используют соединение общей формулы R₁-S-R₂, где R₁ производное гидроксиламина, реагирующее с цитозином в составе НК; S спейсер; R₂ амино- или аминооксигруппа, реагирующая с активированными производными сигнальных соединений, а процесс переаминирования проводят при pH 3,2-4,5 при 60-90^оС в течение 1-12 мин. В качестве переаминирующего агента преимущественно используют 4-аминооксибутиламин, где спейсер S представляет собой тетраметиленовый мостик, позволяющий устранить стерические затруднения между ДНК-дуплексом и R₂.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Раствор НК 1 мг/мл в воде или в буфере, не содержащем производных аминов и карбоновых кислот, смешивают с равным объемом водного раствора 4-аминооксибутиламина дигидрохлорида, pH которого педварительно оттитровывают до 3,75 при 80^оС раствором гидроксида лития;
компоненты смеси перемешивают и смесь инкубируют при 80^оС 5 мин;
модифицированную НК выделяют гельфильтрацией на Sephadex G-25 при элюции 50 мМ бикарбонатом натрия;
НК осаждают из смеси добавлением хлорида натрия до 0,1 М и этилового спирта до 67% с последующим центрифугированием при 12000 g 10 мин;
осадок растворяют в 0,1 М бикарбонате натрия и добавляют затем N-гидроксисукцинимидный эфир D-биотинил-ε-аминокапроновой кислоты до 5 мМ. Инкубируют смесь при 37^оС 30 мин;
биотинилированную НК очищают гельфильтрацией на Sepjadex G-25 при элюции 50 мМ бикарбонатом натрия.

Зонд можно использовать сразу, либо хранить по крайней мере 1 год без потери качества при (-20)^оС в 50 мМ бикарбонате натрия.

Чувствительность гибридизации при использовании зондов, полученных предлагаемым способом, составляет 0,3 пг по гомологической плазмиде, что позволяет выявлять уникальные гены при блот-гибридизации НК.

Существенным отличием предлагаемого способа по сравнению с прототипом является то, что в качестве переаминирующего реагента используют соединения общей формулы R₁-S-R₂ и процесс проводят в оптимальном режиме, а именно в среде с pH 3,2-4,5 при 60-90^оС в течение 1-12 мин, что позволяет повысить качество зонда и расширить его функциональные возможности т.е. возможность метить весь спектр НК (одно- и двуцепочечные поли- и олигонуклеотиды, дезокси- и рибопроизводные). Кроме того, способ позволяет вводить в НК широкий круг сигнальных соединений: биотин, различные флуорохромы и гаптены.

Использование запредельных значений режима проведения процесса переаминирования не позволяет получать зонды высокого качества. Например, при pH реакционной смеси более 4,5 происходит падение скорости модификации. При инкубировании смеси менее 1 мин, не достигается необходимой степени модификации, а более 12 мин происходит падение скорости модификации. При инкубировании смеси менее 1 мин не достигается необходимой степени модификации, а более 12 мин происходит накопление побочного продукта реакции, что снижает качество целевого продукта. При инкубировании смеси при температуре выше 90^оС уменьшается полимерность зондов и соответственно их чувствительность, а при 60^оС падает скорость модификации.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом получить дополнительный технический результат, заключающийся в сокращении количества стадий мечения, увеличении чувствительности гибридизации, повышении устойчивости продукта, а также позволяет расширить круг модифицируемых полимеров.

П р и м е р 1. 50 мкл раствора НК в концентрации 1 мкг/мкл в воде или в буфере, не содержащем производных аминов и производных карбоновых кислот, смешивают с 50 мкл 2 М водного раствора 4 -аминооксибутиламина дигидрохлорида, pH которого предварительно оттитровывали до 3,75 при 80^оС раствором 4,0 М гидроксида лития. Компоненты смеси перемешивают и смесь инкубируют при 80^оС 5 мин. Модифицированную НК выделяют гель-фильтрацией на Sephadex G-50 (20x0,5 см) при элюции 0,2 мл/мин 50 мМ бикарбонатом натрия. За выходом фракций следят по поглощению на 260 нм и на 230 нм. НК осаждают из первой фракции добавлением хлорида натрия до 0,1 М и этилового спирта до 67% с последующим центрифугированием при 12000 g 10 мин. Осадок растворяют в 0,1 М бикарбонате натрия и добавляют затем N-гидроксисукцинимидный эфир D-биотинил-ε- аминокапроновой кислоты до 5 мМ. Инкубируют смесь при 37^оС 30 мин. Биотинилированную НК очищают гель-фильтрацией на Sephadex G-50 в аналогичных условиях.

Проверку качества модифицированной НК осуществляют в реакции гибридизации, осуществляемой по приводимой ниже методике.

ДНК-мишень денатурируют нагреванием в 10 мМ трис-HCl, 0,5 мМ этилендиаминотетраацетате натрия (ТЕ) в течение 5 мин при 98^оС, добавляют NaCl до 1 М и наносят на нитроцеллюлозные мембраны. ДНК иммобилизуют освещением ультрафиолетом [3] Биотинилированный НК-зонд денатурируют нагреванием в ТЕ в течение 5 мин при 98^оС и вносят в раствор, содержащий 0,6 М NaCl, 50% формамида, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% фиколла 400, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 0,5% Tween 20, 40 мМ фосфата натрия pH 7. Гибридизацию фильтра с иммобилизованной ДНК проводят в течение 16 ч при 37^оС, после которой фильтр отмывают 3 раза по 10 мин при 37^оС в 0,5 М NaCl, 50%-ном формамиде, 0,4%-ном SDS, 33 мМ фосфате натрия, pH 7. Затем фильтр инкубируют при перемешивании в 0,2% -ном казеине, 50 мМ трис-HCl pH 7, 0,15 М NaCl, 5 мМ MgCl₂, 0,2%-ной Tween 20 40 мин при 23^оС. Конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза разводят в 2000 раз в 50 мМ трис-HCl pH 7, 0,15 M NaCl, 5 мМ MgCl₂ и инкубируют фильтр в этом растворе 20 мин при 23^оС. От несвязавшегося конъюгата фильтр отмывают с перемешиванием по 10 мин при 23^оС в четырех сменах 0,15 М NaCl, 50 мМ трис-HCl pH 7, 5 мМ MgCl₂, 0,2% Tween 20. Фильтр споласкивают 0,15 М NaCl, 50 мМ трис-НСl pH 9,4; 5 мМ МgCl₂ и затем проявляют в течение 16 ч в растворе такого же состава, но с добавлением 0,33 мг/мл NBT, 0,165 мг/мл ВСIP. По окончании проявления фильтр споласкивают водой и высушивают на воздухе.

Способ поясняется фиг.1 и 2. Гибридизация плазмидного ДНК-зонда, биотинилированного в соответствии с примером 1, не дает сигнала с 1 нг контрольной эукариотической ДНК, а чувствительность гибридизации составляет 0,3 мг гомологичной плазмиды.

Получающаяся чувствительность позволяет выявлять уникальный ген при блот-гибридизации.

Косвенными критериями качества получающегося зонда служат также форма кинетики модификации НК и полимерность продукта, определяемая электрофорезом в денатурирующих условиях.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что pH реагента доводят до 5,0. На фиг.1 приведен график зависимости скорости модификации плазмидной ДНК в концентрации 0,5 мкг/мкл от pH среды. Концентрация 4-аминооксибутиламина 0,5 М, температура модификации 80^оС. По вертикальной оси процент модифицированных оснований, по горизонтальной оси pH реакционной среды при 80^оС.

П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что смесь НК и реагента инкубируют при 98^оС. При этом наблюдают уменьшение полимерности ДНК-зондов, меченных 12 мин в соответствии с примером 3 в зависимости от температуры модификации (полимерность зондов проверяли электрофорезом в 2%-ном щелочном агарозном геле).

П р и м е р 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что инкубируют смесь НК и реагента 15 мин. На фиг.2 приведена кинематика модификации ДНК 4-аминооксибутиламином в соответствии с примером 1. По вертикальной оси процент модифицированных оснований ДНК, по горизонтальной оси время реакции в минутах. Видно изменение линейного характера кинетики модификации из-за исчезновения целевого продукта реакции при времени модификации 6 мин и накопления побочного продукта реакции при времени модификации более 12 мин.

П р и м е р 5. 50 мкл раствора ДНК в концентрации 1 мкг/мкл в воде или в буфере, не содержащем производных аминов и производных карбоновых кислот, смешивают с 50 мкл 0,8 М водного раствора дигидрохлорида дигидразида адипиновой кислоты pH 3,9 (R₁-R₂-карбонилгидразид, S-пентаметилен). Компоненты смеси перемешивают и смесь инкубируют при 80^оС 10 мин. Модифицированную НК выделяют гель-фильтрацией на Sephadex G-25 (20х0,5 см) при элюции 0,2 мл/мин водой. За выходом фракций следят по поглощению на 260 и 230 нм. Элюат концентрируют бутан-1-олом, спирт экстрагируют серным эфиром, эфир удаляют под вакуумом. Добавляют фосфат натрия pH 7 до 0,1 М и N-гидроксисукцинимидный эфир D-биотинил-ε-аминокапроновой кислоты до 5 мМ. Инкубируют смесь при 60^оС 5 ч. Для присоединения красителя добавляют флуоресцеинизотиоцианат до 1 г/л и 0,1 М бикарбонат натрия и инкубируют при 37^оС 3 ч. Биотинилированную или/и флуорохромированную ДНК очищают гель-фильтрацией на Sephafex G-25 как описано ранее.

Проверку качества модифицированной НК осуществляют в реакции гибридизации, осуществляемой по методике, приведенной в примере 1. Гибридизация плазмидного ДНК-зонда, биотинилированного в соответствии с примером 5, дает чувствительность около 20 пг по гомологичной плазмиде.

Дигидразид адипиновой кислоты присоединяется со скоростью, сравнимой со скоростью присоединения 4-аминооксибутиламина. Степень модификации определяют по отношению поглощений на 485 нм и 260 нм флуоресцентного производного ДНК. Полимерность продукта, определяемая электрофорезом в 2%-ном агарозном геле, также показывает пригодность модифицированной ДНК для гибридизации.

П р и м е р 6. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что используют для переаминирования на первой стадии 1,4-ди(аминоокси)бутан. Зонды, модифицированные и 4-аминооксибутиламином, и 1,4-ди(аминоокси)-бутаном, имеют одинаковую чувствительность. На фильтрах нанесена ДНК в количестве: 1 100 пг; 2 31,6 пг; 3 10 пг; 4 3,16 пг; 5 1 пг; 6 0,316 пг.

Использование: биотехнология, медицина, сельское хозяйство. Сущность изобретения: Нуклеиновую кислоту, предназначенную для получения нерадиоактивномеченного зонда, модифицируют путем переаминирования, которое проводят при pH 3,2 4,5 и температуре 60 90°С в течение 1 12 мин, используя в качестве переаминирующего реагента соединение общей формулы R₁-S-R₂ где R₁ - производное гидроксиламина, реагирующее с цитозином в составе нуклеиновой кислоты; S спейсер, R₂ химическая группировка, реагирующая с активированными производным сигнального соединения, которым метят нуклеиновую кислоту после ее модификации. 1 з. п. ф-лы, 2 ил.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕРАДИОАКТИВНОМЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, включающий инкубацию нуклеиновой кислоты в буферном растворе, содержащем переаминирующий реагент, выделение и концентрирование модифицированной нуклеиновой кислоты, мечение ее подходящим сигнальным соединением и очистку от примесей, отличающийся тем, что в качестве переаминирующего реагента используют соединение общей формулы
R₁ S R₂,
где R₁ производное гидроксиламина, реагирующее с цитозином в составе нуклеиновой кислоты;
S спейсер;
R₂ химическая группировка, реагирующая с активированным производным сигнального соединения,
а процесс переаминирования проводят при pH 3,2 4,5 и температуре 60 - 90^oС в течение 1 12 мин. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве переаминирующего агента используют 4-аминооксибутиламин.