Способ получения сорбента для аффинной хроматографии Советский патент 1990 года по МПК B01J20/30 C08B15/00 

Изобретение относится к области химической технологии, а именно к получению сорбента для хроматографии группы антибиотиков-ванкомицинов, и может быть использовано в биохимии и микробиологии.

Целью изобретения является повышение емкости сорбента.

Пример. Получение трипептида р-аланил-глицил-В-аланина.

К раствору 21,5 ммол производного аминокислоты - А1а-ОСН3 и 43 ммоль триэтиламина в 25 мл диме- тилформамида (ДМФА) добавляют 16,1 ммоль производного аминокислоты t- Boc-Gly-OPfp (t,,A 79-80°С), смесь перемешивают 1,5ч при 20°С, растворитель упаривают в вакууме, остаток суспендируют в воде и полученный ди- пептид Boc-Gly-D-Ala-OCHз экстрагируют этил ацетат ом, промывают водой, высушивают над сульфатом натрия, упаривают в вакууме, а остаток выдерживают 20 мин в 10 мл 6 н. НС1 в диокса- не. Растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в 20 мл абсолютного ДМФА и к раствору HCl H Cly-D- Ala-OCHj добавляют 40 ммоль триэтиламина и 10 ммоль Boc-A-Ala-OPfp. Смесь перемешивают 1 ч при 20°С, растворитель удаляют в вакууме, остаток суспендируют в 0,1н, НС1 и трипептид Boc-p-Ala-Gly-D-Ala-OCH э экстрагируют этилацетатом, который выдерживают над и упаривают в вакууме. Остаток после упаривания обрабатывают смесью СНЭОН - 1н. NaOH (2:15 по объему) в течение 45 мин, раствор подкисляют 1н. НС1 до рН 2-,0 и Ala-Gly-D-Ala-OH экстрагируют этил- ацетатом, который затем удаляют в вакууме, К остатку добавляют 4 мл 6н.

СП

Јъ О 00 СЛ

вэ

НС1 в диоксане, через 10 мин растворитель удаляют в вакууме, остаток выдерживают в вакуум-эксикаторе, перекрис- таллизовывают из водного спирта и получают 2,0 г трипептида НС1-р-А1аGly-D-Ala-OH, ,0 +22° (HZ0, ), аминокислотный анализ (после гидролиза 6н. С1, 107йС)- получают : р-А1а (l), Gly (l), D-Ala (I) электрофоре- тически однородное вещество с подвижностью по Ј-Dnp-L V3UЈDL 1,35 в системе НСООН-СН3-СООН-Н70 (28:20:52 по объему). Анализ проводят на автоматическом аминокислотном анализаторе Получение сорбента. 2 г аминоэтилцеллюлозы (АЭЦ) промывают на фильтре 0,1 М раствором щелочи и затем водой до нейтрального значения рН, суспендируют в 0,1 М На-фосфатном буфере с рН 7,6, добавляют глутаровый альдегид в 2-кратном избытке по отношению к свободным аминогруппам АЭЦ (0,1 Мэкв/г), смесь встряхивают в течение 20 ч, активированную АЭЦ фильтруют, промывают водой, суспендируют в 0,1 М Na-фос- фатном буфере с рН 7,8, к смеси добавляют избыток 0,1 г трипептида Н-/э- Ala-Gly-D-Ala-OH, после встряхивания при 20°С фильтруют, осадок промывают водой, суспендируют в 0,1 М Na-боратном буфере при рН 9,1, добавляют 0,1 г Na BH 4 через несколько часов фильтруют. Сорбент промывают до нейтрального рН и высушивают в вакуум-эксикаторе.

100 г сухого сорбента суспендируют в 3 мл 6 М соляной кислоты и тер- мостатируют в вакуумированной ампуле 20 ч при 107 С. После упаривания гидролизата в вакууме проводят количественный аминокислотный анализ на автоматическом анализаторе аминокислот. В 100 мг сорбента содержится по 6,16 мкмоль глицина и аланина и, таким образом, полученный сорбент содержит 61,6 мкмоль лиганда в 1 г сухого образца.

Высокая избирательность сорбции и десорбции на полученном сорбенте .подтверждена на примере следующих антибиотиков ванкомициновой группы

и их производных: ристомицин А, акти- ноидины А и В, ванкомицин, актапланин, А 41030, А 47934, А 35512В, агликон ристомицина А, агликон ванкомицина, агликоны актиноидина А и В, ристо- заминил-агликон ристомицина А и др.

Определение экспериментальной емкости сорбента в отношении антибиотика ристомиццна А,

Через колонку диаметром 1 см, содержащую 1,0 г сорбента, пропускают циркуляционно со скоростью 0,46 мл/мин 10 мл раствора ристомицина А сульфата

5 (20 мг/мл) в 0,02 М а-фосфатном буфере, содержащем 0,5 М, NaCl, до постоянной оптической плотности выходящего раствора, измеренной при Л 280 нм. Сорбент промывают водой

Q от избытка несорбированного антибиотика и затем 0,25 М аммиаком, рН 11,2 до полной элюции антибиотика, Элюат упаривают в вакууме, остаток растворяют в 0,01 М НС1 и определяют оп5 тическую плотность раствора при Л 280 нм. По формуле ЈС1, где Ј 10330, определяют количество сорбированного антибиотика, равное 28 мг. Таким образом, экспериментальQ ная емкость сорбента равна 28 мг/г (13,59 мкмоль/г) или 12,17 мг/мл (5,91 мкмоль/мл сорбента). Антибиотик ристомицин А после выделения с колонки полностью сохраняет свои антимикробные и физико-химические свойства. Константа связывания для ристомицина А равна Ка 9, лМ 1(по известному способу Ко 4,68 10 s ,

5

40

Формула изобретения

Способ получения сорбента для аффинной хроматографии антибиотиков ванкомициновой группы активацией аминоэтилцеллюлозы глутаровым альдегидом с последующей обработкой лиган- дом в буферном растворе и боргидри- дом натрия, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости сорбента, в качестве лиганда используют трипептид д-аланил-глицил-D- - аланин и обработку лигандом проводят .при рН 7,8,

Изобретение относится к химической технологии, конкретно к получению сорбента для аффинной хроматографии антибиотиков ванкомициновой группы, и может быть использовано в биохимии и микробиологии. Изобретение позволяет повысить емкость сорбента до 12, 17 мг/мл за счет того, что сорбент получают активацией аминоэтилцеллюлозы глутаровым альдегидом и последующей обработкой трипептидом β-аланил-глицил-D-аланина в буферном растворе при PH 7,8 и боргидридом натрия.