Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридомной биотехнологии и может быть использовано для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронави- русом.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, который продук- цирует моноклональные антитела (МонАТ) к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота (КРС).

Штамм получают следующим образом.

Клетки миеломной линии ХбЗАд 86.5.3. гибридизуют со спленоцитами мышей, иммунизированных 4 раза с двухнедельным интервалом очищенным ультрацентирифу- гированием в градиенте плотности сахарозы коронавирусом крупного рогатого скота штамма КЛ-2. Первую иммунизацию проводят 50 мкг коронавирусного антигена с полным адьювантом Фрейнда, вторую и третью иммунизации такой же дозой антигена с неполным адьювантом Фрейнда. Последнюю иммунизацию проводят 50 мкг антигена в 0,15М фосфатно-буферном растворе и через 3 дня клетки селезенки используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением к смеси 4x106 миеломных клеток,и 28х106 спленоцитов 1 мл раствора, содержащего 45% ПЭГ-4000,10% диметилсульфоксида и 45% среды RPMI - 1640. Сливающий агент вносят в течение 15 с, затем медленно перемешивают клетки в

о о

го со

течение 60 с и в течение 15 с добавляют 10 мл среды RPMI - 1640, После этого оставляют для инкубации на 10 мин, Далее клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток ресуспендируют в среде RPMI - 1640 с добавлением 10об% эмбриональной сыворотки теленка и высевают в 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку. На второй день после слияния добавляют селективную среду и гипоксантином, аминоптерином и тимидином(ГАТ). Через 10-14 дней из лунок, где выросли клоны клеток, отбирают культу- ральную жидкость для тестирования на активность, т,е, на продукцию антител, Продукцию специфических антител, синтезируемых гибридными клетками, определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием кроличьих антител к иммуноглобулинам мышей, коньюгиро- ванных с пероксидазой хрена и коронави- русного антигена, очищенного в градиенте плотности сахарозы. Гибридные клетки, продуцирующие МонАт, клонируют 2 раза методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм клеток секретирует антитела в культуральную среду или асцитную жидкость,

Штамм гибридных клеток 3 ДтД4 хранится в специализированной коллекции пе- ревиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/№374Д. Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологическая характеристика. Культура состоит из слабоприкрепляющихся к субстрату округлых клеток размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Среда культивирования:среда RPMt - 1640 с добавлением следующих компонентов: 10об% эмбирональной сыворотки теленка; 20 мл/л 200 мМ Z глютамина; HEPES 3,375 г/л: 0,5 мл/л 0,1М 2 меркаптоэтано- ла; 1x10 М пирувата натрия; 100ед/мл пенициллина; 10 мкг/мл стрептомицина; 3,7 г/л бикарбоната натрия, Клетки культивируют при 37°С в атмосфере с 5% С02. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация клеток 2x10 кл./мл. Частота пассирования - через 2-3 сут. При внутрибрюшинной прививке син- генным мышам штамм гибридомы образует . опухоль в асцитной форме на 10-14 день. Доза клеток при прививке - 2х 10 клеток, За

7-14 дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным 2,6,10, раметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 5 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения). Продуктивность штамма, На 3-5 день культивирования гибридо0 мы концентрация (МонАТ) достигает 10мкг/мл в культуральной среде. В очищенной асцитной жидкости концентрация иммуноглобулинов составляет 8 мг/мл.

Характеристика полезного продукта.

5 (МонАТ)относятся к иммуноглобултинам подкласса G2 Ь.(МонАТ)специфически взаимодействуют с гликопротеином (гликолизированная мономерная форма гемагглютинина) с м.мас.62 КДа. Специфичность определяют

0 методом иммуноблотинга. Контаминация.

Контаминантов в клетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы, не обнаружено.

5Криоконсервация.

К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку теленка, а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10%. Суспензию клеток разливают в

0 стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2х106 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на 1 сутки при - 70°С, затем переносят в жидкий азот.

5 Условия размораживания

Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию клеток переносят стерильной пипеткой в

0 центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды, отмывают 1 раз и засевают в ячейки 24-луночной планшеты с питающим слоем перитонеаль- ных макрофагов. Число жизнеспособных

5 клеток после размораживания не менее 70%.

Штамм ЗД1Д4 используют следующим образом.

П р и м е р 1. Гибридные клетки помеща0 ют в пластиковые матрасы площадью 25 см по 5x10 кл. в 5 мл питательной среды, инкубируют 3-4 дня при 37°С в атмосфере с 5% , Культуральную среду собирают центрифугированием 10 мин при 800д для отде5 ления клеток от надосадочной жидкости - супернатанта, содержащего антитела. При культивировании гибридомы на мышах иммуноглобулины из асцитной жидкости получают осаждением сульфато аммония до 50% насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фос- фатно-буферного раствора (ФБР), рН 7,2. Затем добавляют также равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4°С. Иммуноглобулины отделяют центрифугированием при БОООд в течение 30 мин при 4°С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Далее очистку антител проводят на колонке с протеин-А-сефарозой CL-4B. Для этого на уравуовешенную связывающим буфером колонку (1,5 М- глицин, 3 MNaCI доводят до рН 8,9 -MNaOH) вносят по 4 мг/мл осажден ныхеульфатом аммония препаратов иммуноглобулинов, колонку промывают связывающим буфером и антитела элюиру- ют 0,1 М лимонной кислотой, рН 4. Элюат нейтрализуют Ш три-НС1 буфером, рН 8,1. Очищенный препарат антител концентрируют ультрафильтрацией через мембрану РМ 10. Полученные препараты - супернатант и очищеннукгасцитную жидкость.- используют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия (МонАТ) стестируемым антигеном с помощью метода ИФА.

П р и м е р 2. На полистирольной 96-лу- ночной планшет сорбирают очищенный ко- ронавирусный антиген в концентрации 1 мкг в 100 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,5, инкубируют при 4°С в течение ночи. Планшет отмывают 3 раза 0,15 М ФБР и 3 раза 0,15 М ФБР с 0,1% Твином-20 (ФБР- Тв), затем в ячейки планшета вносят двукратные разведения культуральной среды или очищенной асцитной жидкости в количестве 100 мкл и инкубируют в течение 90 мин при 37°С. Планшет отмывают, как описано выше, и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, коньюгированные-с пероксидазой хрена. Через 1 ч инкубации при 37°С повторяют процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции. Связавшийся конь- югат, а значит, и антитела против коронавируса определяют количественно по распаду субстрата Н202 в присутствии ортофенилендиамина. Учитывают результат по интенсивности окрашивания смеси в желто-коричневый цвет, счищают на спектрофотометре с вертикальным потоком света при длине волны 492 нм. Результаты ИФА показывают, что если титр антител в культуральной среде в первый день пересева гибродомы составляет 1:8, то после 3 суток титр повышается до 1:256. Титр антител в очищенной асцитной жидкости равняется 1:512000. Это свидетельствует о том. что 5 гибридома продуцирует специфические мо- ноклональные антитела к коронавирусу крупного рогатого скота.

П р и м е р 3. Для определения молекулярной массы белка вируса, к которому пол- 10 учены моноклональные антитела, проводят электрофорез и перенос вирусных белков на нитроцеллюлозные мембран-ы с последующим иммунохимическим проявлением (им- муноблотинг). Электрофорез белков

5 проводят в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1 % додецилсульфата натрия. Перенос вирусных белков на нитроцеллюлозную-мембрану проводят методом полусухого электроблотинга в аппа0 рате при силе тока 0,8 А на см геля в течение 2 ч. Перенесенные на нитроцеллюлозную мембрану белки окрашивают 0,5%- ным раствором амидочерного. Часть нитроцеллюлозной мембраны используют

5 для иммунохимического проявления антителами. Для этого нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в 1%-ном бычьем сыворочном альбумине (БСА) в течение ночи при 4°С, затем обрабатывают очищенными

0 препаратами антител в разведении 1:100 и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, коньюгирован- ными с пероксидазой хрена. Реакцию визу5 ализируют инкубацией нитроцеллюлозных

мембран в растворе следующего состава: 4

мг хлорнафтола; 1 мл метанола; 5 мл ФБР;

5 мкл 30%-ного раствора перекиси водорода.

При электрофорезе обнаруживают бел0 ки с мае. 170, 100, 62, 53 и 23 кДа. После иммунохимического проявления белков, перенесенных на нитроцеллюлозные мембраны, обнаруживается одна полоса м.мас. 62 кДа, что указывает на то, что моноклональ5 ные антитела специфически связываются .с вирусным белком м.мас.62 кДа. Формул изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N°

0 374Д, продуцирующий моноклональные антитела к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота.

Изобретение относится к гибридомной биотехнологии и может быть использовано для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом. Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, который продуцирует моноклональные антитела (монат) к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота (КРС). Штамм получают гибридизацией миеломных клеток линии Х63Ад 86.5.3. со спленоцитами мышей, иммунизированных коронавирусом крупного рогатого скота. Полученный штамм ЗД₁Д₄ секретирует МонАТ JGG2B специфически взаимодействующие с гликопротеином коронавируса КРС. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 374Д и характеризуется типичными для гибрида культуральными свойствами: среда культивиров ания RPMI - 1640 с 10%-ной эмориональной сывороткой теленка, посевная концентрация 2^.10⁵ кл./мл, частота пассирования - через 2 - 3 сут. Продуктивность штамма 10 мкг/мл МонАТ в культуральной среде и 8 мг/мл в асците.