Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к поверхностному антигену возбудителя туляремии голарктической расы Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя туляремии голарктической расы.

Штамм получают следующим образом.

Белых мышей иммунизируют внутри- брюшинно три дня подряд живой культурой вакционного штамма Francisel- la tularensis 15 Гайского в дозе 1- 100 м. кл/мышь и затем ревакцинируют внутрибрюшинно через 10, 11, 12 дней дозой 1 млн.м.кл. На четвертый день после последней иммунизации проводят соматическую гибридизацию клеток селезенки и мышиной миеломы P3-X63/Ag 80653. Слияние клеток миеломы с клет

ками селезенки мышей проводят с помощью 50%-ного раствора полиэтилен- гликоля с Mr 1500Д„ В стерильных условиях извлекают селезенку и измельчают ее с помощью гомогенизатора типа Даунса. Взвесь фильтруют через два слоя марли и обрабатывают 0,83%-ным раствором , эабуферен- ным трис-буфером для лизирования эритроцитов. Лимфоциты дважды отмывают средой Игла-MEM и смешивают с дважды отмытыми клетками миеломы в соотношении 5:1 (клетки селезенки: миеломные клетки). Смесь клеток отмывают один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к сухому осадку добавсд

Ј

Ю

СД

со

ляют 1 мл 50%-ного раствора полиэти- ленгликоля в течение 1 мин по каплям при 42° С (на водяной бане). После этого в центрифужную пробирку медленно вносят бессывороточную среду Игла-МКМ в объеме до 20 мл Взвесь клеток инкубируют при 37 С 10 мин, после чего один раз центрифугируют при 800 об/мин 7 мин. Супернатант декантируют и смесь клеток осторожно ресуспендируют в 40 мл ростовой среды (среда RPMI 1640 или ДМЕМ с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ/мл глютамина, 4 г/л j глюкозы, 0,1 М пирувата натрия), содер-1

10

при 37° С в пластиковой или стеклян- ной посуде при посевной дозе 150- 200 тыс./мл в течение 3-4 дней до плотности насыщения 800 тыс./мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня той же дозой. Коэффициент рассева 1:4-1:5. Культивирование ведут на питательной среде RPMI 1640 или ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 8-10 мМ буфера HEPES.

Культивирование штамма в организме экспериментальных животных. Индукцию асцитных опухолей у интактных беспородных белых мышей и инбредных

жащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл

гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/мл тимидина).

Суспензию клеток в ГАТ-среде разлива-2Q 0,5 мл/мыгаь., осуществляют путем иноют по 0,1 мл в четыре 96-луночных/ а-.тг,,„„г, in.infc

мышей линии Ва1Ъ/с, внутрибрюшинно праймированных за 14 дней до введения гибридомы пристанем в дозе

/кулирования гибридных клеток на одно животное в 3 мл среды. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных

плоскодонных культуральных плато на фидерный слой предварительно высеянных (за сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 10000 на лунку0 Видимые колонии гибридных кле- трк появляются на 7-1 0 день. Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ, после чего переводят на ростовую среду без селективных компонентов. Гибридому дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из мышиных перитонеальных макрофагов. В результате клонирования .получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) заданной специфичности.

Штамм обозначают ГТ-С7/65, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) К5 238Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Гибридные клетки ГТ-С7/65 представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы. Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина. В значительной части клеток цитоплазма имеет выросты.

Культуральные признаки типичны для перевиваемых клеток мышиных плазмоцитом. Клетки ГТ-С7/65 культивируют в виде стационарной суспензии

при 37° С в пластиковой или стеклян- ной посуде при посевной дозе 150- 200 тыс./мл в течение 3-4 дней до плотности насыщения 800 тыс./мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня той же дозой. Коэффициент рассева 1:4-1:5. Культивирование ведут на питательной среде RPMI 1640 или ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 8-10 мМ буфера HEPES.

Культивирование штамма в организме экспериментальных животных. Индукцию асцитных опухолей у интактных беспородных белых мышей и инбредных

мышей линии Ва1Ъ/с, внутрибрюшинно праймированных за 14 дней до введения гибридомы пристанем в дозе

0,5 мл/мыгаь., осуществляют путем ино/ а-.тг,,„„г, in.infc

кулирования гибридных клеток на одно животное в 3 мл среды. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных

опухолей через 22-30 дней в объеме 2-17 мл. Культуру клеток поддерживают в течение трех пассажей асцитной опухоли на мышах (срок наблюдения), Кариологические признаки. Модалъное число хромосом 88, С-маркеры родительской миеломной линии P3-X63/Ag 8.653.

5

0

5

0

5

Характеристика моноклональных антител. МонАТ относится к классу IgM. Они выявляют поверхностный антиген, присутствующий на микробных клетках вирулентных и авирулентных штаммов возбудителя туляремии голарктической расы, но не на клетках среднеазиатской и неарктической рас. Антитела тестируют в реакции непрямой иммуно- флуоресценции, иммуноферментном анализе, реакции непрямой гемагглюти- нации и реакции двойной иммунодиф- фузии с использованием живых и убитых формалином или фенолом микробных клеток. В качестве эритроцитарного диагностикума используют формалини- зированные, танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные фракцией слизистого вещества вирулентного штамма возбудителя туляремии голарктической расы. Класс иммуноглобу-. линов определяют в реакции преципитации по Оухтерлони.

Титр монАТ в культуральной жидкости составляет 1:100 (НИФ), 1:1000- .1:2000 (ИФА), в асцитической - 1:

15

20

:25600-1:512000 (ИФА), до 1:20000 , (НИФ), до 10240 (РИГА).

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются.с

Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640$ содержащей 50% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% глицерина или 10% ди- 10 метилеульфоксида. Замораживание проводят в программном замораживателе со снижением температуры на 1°С (до -40°С), далее на 10°С (до -100°с. Затем клетки помещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток по включению трипано- вого синего составляет 75-92%.

Пример 1. Культуру, выделенную от грызуна при эпизоотологичес- ком обследовании природного очага туляремии, выращивают на плотной питательной среде с 0,1% цистеина. Готовят 1 млрд. суспензии клеток в25 фосфатном буферном растворе (ФБР) рН 7,4, из которой приготавливают мазки и фиксируют этанолом в течение 20 мин. На фиксированные мазки нано- сят по 1 капле препарата монАТ 30 конъюгированного с ФИТЦ. После инкубации 40 мин во влажной камере при 37 С препараты промьюают в трех сменах ФБР. рН 7,4 и один раз /ополаскивают дистиллированной водой. Мазки высушивают на воздухе и затем просматривают на люминесцентном микроскопе ЛОМАМ И-2 под иммерсией (об, 90 хок„ 10) с использованием нефлуоресцирующего иммерсионного масла или ди- метилфталата. Ярко-зеленое свечение , на темном фоне мелких коккобактерий возбудителя туляремии расценивают как- специфическое. При наличии специфического свечения при просмотре пози- .45

35

40

5

0

с

0

5 0 5

5

0

тивного контроля, основанного на использовании туляремийной люминесциру- ющей сыворотки, делают заключение о том, что выделенная культура относится к виду F. tularensis голарктической расы.

Пример 2. Изучаемую культуру обрабатывают аналогично примеру 1 . На фиксированные мазки наносят по 1 капле асцитного препарата монАТ и инкубируют в течение 40- 60 мин во влажной атмосфере при 37°С. После этого проводят трехкратную отмывку препаратов ФБР рН 7,4 и однократно ополаскивают дистиллированной водой. Мазки подсушивают на воздухе, после чего наносят конъюгат- кроличью антисыворотку против иммуноглобулинов мыши, меченную ФИТЦ. Мазки с нанесенным антивидовым конъюга- том инкубируют во влажной камере при 37 С в течение 40-60 мин, после чего трехкратно отмывают ФБР рН 7,4 и однократно ополаскивают дистиллированной водой,, Подсушенные на воздухе мазки просматривают и учитывают результаты аналогично примеру 1.

Таким образом, предлагаемый штамм является активным продуцентом монАТ, специфически взаимодействующим с поверхностным антигеном возбудителя туляремии голарктической расы, и может быть использован в диагностических целях.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus ВСКК(П) № 238 Д, используемый для получения моноклональных антител к поверхностному антигену возбудителя туляремии голарктической расы.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя туляремии голарктической расы. Штамм получают путем слияния клеток миеломы Р3-Х63/AG8.653 с клетками селезенки мышей, линии BALB/с и депонирован под номером ВСКК(П) N 238Д. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки при 37°С. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня

коэффициент рассева 1:4-1:5. Секретируемые монАТ относятся к классу JGM, а титр их в культуральной жидкости составляет 1:100(НИФ), 1:1000-1:2000 (ИФА), в асцетической-1:256000-1:512000 (ИФА) до 1:20000 (НИФ), ДО 1:10240 (РНГА). МОНАТ МОГУТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАНЫ В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ.