Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS. мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к гликопротеину Е /V 3/ вируса клещевого энцефалита Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

1

(21)4674770/13

(22)10с04с89

(46) 30.07.91„ БюЛо № 28

(71)Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АНН СССР и Институт иммунологии

(72)С.Н.Атанадзе, В„И,Новиков, с Рубин, ИоВоКрасильников, И,АсНиколаева и ИоГоСидорович

(53)678 о085о 23(088 о8)

(56)Heing F.X., Berger R0, Majdie 0. е.а„ - Infect. Ironunolc, 1982, 37, 784 - 869.

(54)ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЪТИВИРУЕгЕЫХ КЩТОК ЖИВОТНЫХ MUS, MUSCULUS L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПЖКОПРОТЕИНУ Е (V 3) ВИРУСА КЛЕЩЕВОг- IX) ЭНЦЕФАЛИТА

(57)Изобретение относится к гибри - домной технологии и может быть пользовано для аффинной очистки копротеина Е (V 3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Цель изобретения «получение штамма гибридомы, проду цирующей низкоавидные моноклональные антитела (монАТ) к ВКЭс Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X63oAg8c653 с клетками селезенки мьг шей Balb/c, иммунизированных очищен - ным антигеномо Штамм культивируют в суспензионно-монослойной культуре в среде RPM I 1640 с 15% сыворотки эмбриона коровы, 2 mM L-глутамина, 50 мкг/мм гентамиц 1на,а также в брили - ной полости сингенных мышей. Специ - фичность монАТ определяют методом твердофазного иммуноферментного ана лиза на том ке антигенес Кроме тогоэ монАТ активны в реакции торможения гемагглютинации,, МонАТ не выявляются в реакциях связывания комплемента, преципитации в агаре и нейтрализации Константа связывания с дрЕ равна 6, М„ МонАТ принадлежат к су JgG1c Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 282 Do

§

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для аффинной очистки гликопротеина E(V3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей низкоавидные моноклональные антитела (монАТ) к ВКЭ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X63.AG8.653 с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных очищенным антигеном. Штамм культивируют в суспензионно-монослойной культуре в среде RPM I 1640 с 15% сыворотки эмбриона коровы, 2 MML - глутамина, 50 мкг/мм гентамицина, а также в брюшной полости сингенных мышей. Специфичность монАТ определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа на том же антигене. Кроме того, монАТ активны в реакции торможения гемагглютинации. МонАТ не выявляются в реакциях связывания комплемента, преципитации в агаре и нейтрализации. Константа связывания с дрЕ равна 6,4 ^. 10^-6 М. МонАТ принадлежит к классу 1 GGI. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N282D.

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть исполь- зовано для аффинной очистки глико- протеина Е (v3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей низ- коавидные моноклональные антитела монАТ к ВКЭс

Штамм V ВСКК (II) 283 D получают следующим образом.

Клетки миеломы РЗ.Х63.Ag80653 сливают со спленоцитами мыщей линии

Balb/c, иммомучнзированных гликс- протеином Е вируса КЭ западного типа (штамм 256) , Иммунизацию мышей прово - дят 4-кратно с недельными интервалами (первичная иммунизация 5 мкг белка с полным адъювантом Фрейнда внутрибркк- шинно, посшедукяще - те же дозы белка на физиологическом растворе)„

Сливающим агентом служит 50%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мо лекулярной массой 6000. К осадку ток, содержащему 10-10 клеток миело мы и клеток селезенки мышей,

3166

выделенных на 4 сутки после последней иммунизации белком Е, добавляют 1 мл 50%-ного раствора ПЭГа„ После легкого перемешивания в течение 1 мин к клётг- кам с ПЭГом добавляют обычную культу ральную среду без сыворотки, доводя конечный объем до 10 мл в течение 5 мин при постоянном перемешивании,, Затем клетки отмывают низкоскорост- ным центрифугированием в течение 5 мино

Осадок разводят средой для культи вирования гибридом, содержащей гипок«- сантинаминоптеринтнмидин (ГАТ), и

разливают в 96-луночные панели, куда накануне засевают перитонеальные макрофаги и тимоциты (1-5-105 макро - фагов и 1 -107 тимоцитов на панель) сингенных мышейс

Через 8-12 сут инкубирования в атмосфере с углекислого газа при 37°С определяют количество образую1 щихся колоний гибридомных клеток Посредством твердофазного иммунофер - ментного анализа оценивают число лоний секретирующих антитела к глико - протеину Е вируса КЭ. Клетки из лунок в супернатанте которых обнаруживают синтез специфических антител, подвёр гают клонированию Последнее проводят в 96-луночных панелях методом пре дельных разведений (50,5 и 0,5 ток на лунку) „ Для последующих рекло - нирований отбирают лунки, в которых обнаруживается синтез специфических антител, при наличии в них не более 1-2 колоний Всего проводят 5 реклони рованийу после чего полученный штамм переводят в массовую культуру - чале в количестве 2«10 клеток в 10 мл среды, а затем 4Ч06 клеток в 25 мл среды

Ытамм характеризуется следующими свойствами о

При оптимальных условиях культиви - рования жизнеспособность клеток равна 95-98%о Время удвоения, определяемое путем прямого подсчета количества клеток в суспензии, меняется в зави симости от условий культивирования в диапазоне ч„ За период дня после посева клетки претерпевают 1- 2 деления и достигают плотности

6-8-10Г клеток в 1 мл. В культурах с более высокой плотностью отмечается повышенная гибель клеток„ Кратность рассева равна 1 + 2 - 1+3,.

,. Q

$

0

Клетки штамма после четырех рекло- нирований переводят с селективной среды с добавлением ГАТ на обычную среду следующего состава: среда RPMI-1640 с 15% фетальной телячьей сыворотки и 2 мМ L-глютамина. Для исключения возможности бактериально го пророста в среду добавляют гента - мицин в дозе 50 мкг/мл„

Гибридома по типу роста является суспензионной культурой и растет в виде гроздей из клеток и в ветле единичных клетокс Характер роста меняется в зависимости от качества используемого пластика или стекла Пересев культуры осуществляют путем энергичного встряхивания культуралы- ного сосуда или смывом клеток с культуральной поверхности средой под давлением из шприца в случае роста культуры в виде монослоя. Морфология клеток предлагаемого штамма -клетки неоднородны по форме и размерам, но преимущественно имеют округлую форму и неровные края

При внутрибрюшинной трансплантат ции клеток гибридомы син генным мышам, получившим предварительно за сут внутрибрюшинно по 0,3 мл пристава, отмечается рост опухоли в асцит ной форме через 15 сут0 От 1 мыши получают от 1 до 6 мл асцитной жидкости

Культура клеток штамма не конта - минирована грибами, бактериями, вирусами и микоплазмамиь

Криоконсервирование клеток ридомы проводят на среде, состоящей из 90% фетальной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида„

Пнбридома продуцирует монАт к новиому функциональному белку оболоч - ки вируса КЭ - к г ли копр от ей ну Е Антитела относятся к подклассу IgG1« Титр антител по данным иммунофер ментного анализа в культуральной жиде- кости равен 1«-2 -Ю2, а в асцитной жидкости 1-. 1-10у„ Антитела не выявляются в реакциях связывания комплемента диффузионной преципита - 1$ш в агаре и нейтрЈ1лизациис В то же время они активны в реакции тормо - жения гемагглютинации (титр 1/1бО)0 Активность антител низкая - консташ- та связывания равна 6, .

Пример Выд шение белка Е вируса КЭ методом аффинной хроматографин с применением монАТ вырабатываемых гибридомойо

МонАТ получают, трансплантируя внутрибрюшинно по 1-510 клеток предлагаемого штамма гибридомы син«- генным мышам, получившим предвари - тельно за 20-30 сут внутрибрюшинно по 0,3 мл пристава„ Рост опухоли мечают в асцитной форме через 15 суто Объем асцитной жидкости, получаемой от 1 мыши, колеблется в пределах 1-6 мл„ Титры монАТ к глико протеику Е в асцитной жидкости по данным иммуноферментного анализа равны 1-10-4 г- 1

Для аффинной хроматографии колон ки размером 1x5 см заполняют макро - пористым стеклом, модифицированным либо поликлональными антителами к вирусу КЭ, либо монАТ, секретируемыми предлагаемым штаммом„

На каждую из колонок наносят сус- пензию, содержащую гликопротеин Е вируса КЭ в количестве 5 мг. После адсорбции белка колонки промывают О,1 М фосфатно-солевым буферным раствором и элюируют белок Е 0,1 М НС1 буфером, рН 8,5 с градиентом хлористого натрия, а затем - тем же буфером с градиентом тиоцианата ка«ЛИЯ0

Из колонки с сорбентом, модифици - рованным поликлональными авидными антителами, при использовании диента хлористого натрия белок Е не элюируетсЯо При использовании в качестве элюирующего агента М тиоциана та калия йыход белка на этой колонке составил 30% от нанесенного на коло№ ку количества белка, а его специфическая активность 10%0

Из колонки с сорбентом, модифицированным монАТ, секретируемыми предла

гаемым штаммом, выход белка Е состав - ляет 70% при использовании в качест ве элюирующей жидкости вьшеназва н- ного буфера с 0,6 М хлористого рия„ При этом специфическая актив - ность полученного белка полностью со храняется„

Благодаря низкой авидности анти тел при использовании их в аффинной хроматографии можно применять щадящие воздействия для разрыва связи антитело - антиген, что позволяет избежать денатурации антигена и обеспечивает его высокий выходо

Так, выход антигена (белок Е виру са КЭ) при аффинной хроматографии с использованием авидных антител, со ставляет 30%, а применение ннзкоавид - ных монАТ, секретируемых полученной гибридомой, позволяет повысить выход антигена до 70% „ При этом удается по«- лучить примерно в 7 раз больше ант

гена, сохранившего свои серологи - ческие свойства (из колонки с бентом, модифицированным авидными антителами, отмечается выход 10% бел«- ка Е, сохранившего активность в серо логических реакциях, от количества белка, нанесенного на колонку, выход белка Е, сохраняющего активность в серологических реакциях, из колонки с макропористым стеклом, модифици рованным монАТ, вырабатываемыми

лученной гибридомой, составляет 70%). Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - BCKK(II) У 283D - продуцент моноклог- нальных антител к гликопротеину Е (v.3) вируса клещевого энцефалита.