Способ получения карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи Советский патент 1990 года по МПК C12N9/48 

1

(21)4344108/30-13

(22)15.12.87

(46) 23.03.90. Бюл. N 1 1

(71)Научно-производственное объединение Биолар и Латвийский государственный университет им. П.Стучки

(72)Д.Ж.Менее, А.А.Марнауза, А.Х.Швагере, Д.А.Клявиня, Т.Ф.Фридман и М.П.Путере

(53)663.15(088.8)

(56) Folk J.R., Schirmer E.W. The Porcine Pancreatic Carboxypeptidase a System. - Journal of Biological Chemistry, 1963, v. 238, p. 3884-3894. Dia R.D., Srivastava S.K. A Method for Simultaneous Purification of Carboxypeptidase a and В from Goat Pancreas and the Product Stabilization of Goat Carboxypeptidase B. - Journal of Molecular Catalysis, 1981, v. 10, N 3, p. 253-268.

(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕПТИ- ДАЗЫ А И КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ В ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ СВИНЬИ

(57) Изобретение относится к способу комплексного получения ферментов из животного сырья, а именно карбокси- пептидазы А и карбоксипептидазы В, применяемых в биохимии для структурных исследований. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ включает экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, выделение и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-цел- люлозе. Экстракцию проводят 0,005 У трис-HCl буфером, из полученного экстракта сульфатом аммония при степени насыщения 0,64-0,66 осаждают комплекс карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В, причем сначала элюи- рутот карбоксипептидазу В в линейном градиенте концентрации хлорида натрия от 0 до 0,25-0,26 М в 0,005 М трис-HCl буфере элюируют карбоксипептидазу А. Буферный раствор на всех стадиях имеет рН 7,5-7,6.

I

(Л

Изобретение относится к способу комплексного получения ферментов из животного сырья, а именно карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В, применяемых в биохимии для структурных исследований. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ включает экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, выделение и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Экстракцию проводят 0,005 М трис-HCL буфером, из полученного экстракта сульфатом аммония при степени насыщения 0,64-0,66 осаждают комплекс карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В, причем сначала элюируют карбоксипептидазу В в линейном градиенте концентрации хлорида натрия от 0 до 0,25-0,26 М в 0,005 М трис-HCL буфере, после чего 0,26 М раствором хлорида натрия в 0,005 М трис-HCL буфере элюируют карбоксипептидазу А. Буферный раствор на всех стадиях имеет PH 7,5-7,6.

Изобретение относится к способу комплексного получения ферментов из животного сырья, а именно карбокси- пептидазы (КП) А и КП В, применяемых в биохимии для структурных исследований.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.

Способ включает экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, выделение и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Экстракцию проводят 0,005 М трис-HCl буфером, из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении 0,64-0,66 (рН 7,5-7,6) осаждают комплекс КП А и КП В, который разделяют на хроматографической колонке последовательным элю- ированием КП В и КП А, причем сначала линейным градиентом при возрастающей концентрации натрия хлористого до 0,25-0,26 М в 0,005 М трис-HCl буфере элюируют КП В, после чего 0,26 М раствором натрия хлористого

в 0,005 М трис-HCl бубере выделяют КП А, а рН буферного раствора на всех стадиях 7,5-7,6. Пример 1 .

I.Приготовление ацетонового порошка.

0,7 кг свежезамороженных поджелудочных желез разрезают на кусочки толщиной 4-6 toM и пров.одят автолиз при комнатной температуре 20-24 ч. Полученную массу обрабатывают при комнатной температуре четырьмя объемами ацетона, интенсивно перемешивая в течение 1 мин. Аналогично проводят обработку желез еще 3 раза ацетоном, смесью ацетона и эфира (1:1) и эфиром. Обработанные железы сушат при комнатной температуре.

II.Экстракция.

Ацетоновый порошок из автолизиро- ванной поджелудочной железы свиньи перед экстракцией размельчают в электрической лабораторной мельнице. К 140 г ацетонового порошка добавляют 1400 мл 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5) и перемешивают 45 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием. Получают 1300 мл цент- рифугата желтоватого цвета. рН экстракта доводят до 7,5 с помощью 1 У раствора NaOH.

III.Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония .

I

К экстракту по порциям, перемешивая на магнитной мешалке, добавляют сульфат аммония до 0,64 насыщения (422,3 г/л), поддерживая рН 7,5 1 М раствором NaOH.Продолжают перемешивать еще 30 мин. Центрифугируют 40 мин при 6000 об./мин при 3 С. Белковый осадок, содержащий КП А и КП В, суспендирую, в 350 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН 7,5), помещают в целлофановые мешочки и диализируют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 24 ч против охлажденного 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,5). Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Центрифугат в количестве 400 мл используют для дальнейшей очистки.

IV. I хроматография на колонке 6 . 25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,5).

На колонку наносится 400 мл раствора белка, полученного на стадии III. Колонку промывают 5 л 0,ООЬ М

трис-HCl буферного раствора (рН 7,5) для освобождения от неадсорбированного белка. Белковую Фракцию КП В элюируют линейным градиентом концентрации NaCl: в первом сосуде - 1 л

0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,25 М NaCl.Объединяют фракции с удельной активностью КП В не менее 50 ед/мг белка (600 мл).

5 Белковую фракцию КП А элюируют

1 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5) с 0,25 М NaCl. Объединяют фракции с удельной активностью КП А не менее 12 ед/мг белка (520 мл).

Q К полученным с колонки хромато- графическим фракциям КП А и КП В добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при

5 6000 об/мин- и 3°С и растворяют в 50 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН 7,5). Растворы помещают в целлофановые мешочки и диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5).

0 Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

Центрифугаты КП А (45 мл) и КП В (50 мл) используют для дальнейшей

очистки.

V. Очистка КП В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Лиализат от стадии IV, содержащий КП В активность, наносят на колонку

с ДЭАЭ-целлюлозой (2,9 25 см),урав- новешанной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,5) со скоростью течения 30- 40 мл/ч, отмывают от неадсорбированных белков 800 мл этого же буфера.

Элюирование КП В проводят линейным градиентом NaCl: в первом сосуде - 500 мл-0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5), а во втором - 500 мл этого же буфера с 0,25 М NaCl. Объединяются фракции с удельной активностью КП В не менее 100 ед/мг белка. К элюату добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 20 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН 7,5).Диа лизуют в течение 24 ч против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5). Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

Выход 20 мл раствора фермента с удельной активностью КП В 149 ед/мг белка, выход по активности 35,7%,

VI.Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

I

45 мл раствора КП А от стадии IV

наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,5) со скоростью течения 30-40 мл/ч, отмывают от неадсорбированных белков 1 л этого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде 1 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,3 М NaCl. Объединяются фракции с удельной активностью КП А не менее 16 ед/мг белка (200-300 мл) К элюату медленно по порциям, перемешивая на магнитной мешалке, добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием в течение 50 мин при 6000 об/мин при 3еС и растворяют в 20 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН 7,5 Диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,5) в течение 24 ч. Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

VII.Кристаллизация КП А. Центри- фугат помещают в целлофановые мешочки и диализутот против дистиллированной воды в течение 36 ч. Осадок КП А отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 15000 об/мин при 3 С и суспендируют в 40 мл дистиллированной воды, медленно перемешивая на магнитной мешалке 30 мин для отмывки от растворимых в воде примесей. Осадок отделяют центрифугированием и вновь суспендируют в 20 мл воды. К суспензии медленно по каплям, прове- няя рН, прибавляют 0,1 М NaOH до

рН 6,8. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Пентрифугат помещают в целлофановые мешочки и диализуют в течение 36 ч против дистиллированной воды. К образовавшейся суспензии кристаллов КП А добавляют I мл толуола (5% от объема суспензии).

Выход 20 мл суспензии фермента, содержащей 4000 Е КП А с удельной активностью КП А 29,7 ед/мг белка, выход по активности 32% (по международным единицам определения активности ферментов).

, . )

551742

П р и м е р 2.

I. Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру 1. II Экстракция.

Ацетоновый порошок перед экстракцией размельчают. К 140 г ацетонового порошка добавляют 1400 мл 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,55) и перемеши- Ю вают 45 мин при комнатной температуре. Центрифугируют, рН полученного экстракта доводят до 7,55 1 М раствором NaOH.

III. Осаждение ферментного комплек- 15 са КП А и КП В сульфатом аммония.

К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения (430,4 г/л), поддерживая рН 7,55 1 М раствором NaOH.Осадок отделяют центрифугиро- 2о ванием и суспендируют в 350 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН 7,55), диализутот в течение 24 ч против 0,005 М трис- HCl буфера (рН 7,55). Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. 25 IV. I хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

На колонку 6 25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис- HCl буфером (рН 7,55), наносится 30 400 мл раствора белка от стадии III. Для освобождения от неадсорбированного белка колонку промывают 5 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,55). КП В элюируют линейным градиентом Зб концентрации NaCl: в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,55), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,255 М NaCl. Объединяют фракции с удельной активностью КП В не менее 40 50 ед/мг белка (600 мл).

КП А элюируют 1 л 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,55) с 0,255 М NaCl. Объединяют фракции с удельной активностью КП А не менее 12 ед/мг белка. 45 Фракции КП А и КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 50 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,55) и диализуют против 5о 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,55).

V. Очистка КП В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлоэ е.

Диализат от стадии IV с КП В ак- .тивностью наносят на колонку с ДЭАЭ- 55 целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,55). Отмывают от неадсорбированных белков 800 мл этого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде - 500 мл.

0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,55), а во втором - 500 мл этого же буфера с 0,25 F NaCl. Объединяются фракции с удельной активностью КП В не менее 100 ед/мг белка, осаждаются сульфатом аммония до 0,65 насыщения. Осадок после центрифугирования суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,;55). Диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,55). Центрифугируют.

Выход 20,5 мл раствора фермента с удельной активностью КП В 151,5 ед/ белка, выход по активности 33,7%.

VI.Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ-целлюлоэе.

Диализат от стадии IV с КП А активностью наносят на колонку с ДЭАЭ- целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl бусЬером (рН 7,55), отмывают от неадсорбированных белков 1 л этого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде - 1 л 0,005 N трис-HCl буфера (рН 7,55), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,3 М NaCl. Объединяют фракции с КП А активностью и осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 20 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН 7,55). Диализуют против 0,005 М трис-HCl буфела (рН 7,55).

VII.Кристаллизацию КП А проводят аналогично примеру 1.

Выход 19,5 мл суспензии фермента с удельной активностью КП А 32,5 ед/мг белка, выход по активности 31,5%. I

П р и м е р 3.

I.Приготовление ацетонового-порошка проводят аналогично примеру 1

II.Экстракция.

К 140 г ацетонового порошка добаляют 1400 мл 0,005 М трис-HCl буфера рН 7,6. Перемешивают 5 мин, ценрифугируют, рН экстракта доводят до величины 7,6 1 М раствором NaOH.

III.Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония.

К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,66 насыщения (438,8 г/л) поддерживая рН 7,6 1 М раствором NaOH. Центрифугируют, осадок суспендируют в 350 мл 0,05 М трис-HCl буфера рН 7,6, диализуют против 0,005 трис-HCl буфера рН 7,6.

IV.I хроматография на ДЭАЭ-целлю- лозе.

Диализат от стадии III наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,6), промывают 5 л этого же буфера. Для элюирования КП В ставится градиент: в первом сосуде - 1 л

0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,6), а во втором - I л этого же буфера с 0,26 М NaCl. КП А элюируют 1 л 0,005 М трис-HCl буфера рН 7,6 с 0,26 М NaCl.

Объединенные фракции КП В и КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, отделенный центрифугированием осадок суспендируют в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,6) и диализуQ ют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,6).

V.Очистка КП В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлоэе.

Диализат с КП В активностью на5 носят на к.шонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,6), элюируют линейным градиентом концентрации NaCl: в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-HCL

0 буфера (рН 7,6), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,25 М NaCl. Объединенные фракции КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок после центрифугирования растворя5 ют в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,6). Диализ проводится против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,6),

Выход 21 мл раствора фермента с удельной активностью КП В 155 ед/мг

0 белка, выход по активности 38,3%.

oVI. Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии IV с КП А активностью наносят на колонку с ДЭАЭ5 целлюлозой уравновешенной 0,005 У. трис-HCl буфером (рН 7,6), пропускают 1 л этого же . Ставится градиент: в первом сосуде - л 0,005 М трис-HCl буфер (рН 7,6), а

Q во втором - 1 л этого же буфера с 0,3 М NaCl. Объединяют фракции с КП А активностью, осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения и осадок после центрифугирования раствори

5 ют в 20 мл 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,6)..Диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,6).

VTI. Кристаллизацию КП А проводят аналогично примеру 1,

Выход 20 мл суспензии ферментл с удельной активностью КГ А 30,2 ед/мг белка, выход по активности 31,8%.

II р и м е р 4.

I.Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру 1.

II.Экстракция.

Экстракцию проводят 0,005 М трис- НС1 буфером (рН 7,А), рН экстракта после центрифугирования доводят до величины 7,4 1 М раствором NaOH.

III.Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония

К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,63 насыщения (414,2 г/л), поддерживая рН 7,4 1 М раствором NaOH. Осадок после центрифугирования суспендируют в 350 мл 0,05 У трис-HCl буфера (рН 7,4), диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,4).

IV.I хроматография на ДЭАЭ-цел- люлозе.

Диализат от стадии III наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,4), пропускают 5 л этого же буфера. Для элюирования КП В ставится градиент: в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-HCl буфера рН 7,4, а во втором - 1 л этого же буфера с 0,24 М NaCl. КП А элюируют 1 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,4) с 0,24 М NaCl.

Объединенные фракции КП В и КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок после центрифугирования суспендируют в 0,05 М трис- HCl буфере (рН 7,4) и диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,4)

V.Очистка КП В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Фракцию КП В от предыдущей стадии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис- HCl буфером (рН 7,4), элюируют линейным градиентом концентрации NaCl: в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,4), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,25 М NaCl. Объединенные фракции КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок растворяют в 0,05 М трис-HCl буфера (рН 7,4). Диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,4).

Выход 17,5 мл раствора Лермента с удельной активностью КП В 107,4 ед/м белка, выход по активности 24%.

.

10

20

25

551742Ю

VI.Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Фракция КП А от стадии IV наносится на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,4), промывают колонку 1 л этого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,4), а во втором - I л этого же буфера с 0,3 М NaCl. Объединенные фракции КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения. Осадок растворяют в 0,05 М J5 трис-HCl буфере (рН 7,4). Диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,4).

VII.Кристаллизацию КП А проводят аналогично примеру 1.

Выход 18 мл суспензии фермента с удельной активностью КП А 22,6 ед/мг белка, выход по активности 28%.

П р и м е р 5.

I.Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру I.

II.Экстракция.

Экстракцию проводят 0,005 М трис- HCl буфером (рН 7,7), рН экстракта после центрифугирования доводят до величины 7,7 1 М раствором NaOH.

III.Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония.

К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,67 насыщения (447,2 г/л), поддерживая рН 7,7 1 М раствором NaOH. Осадок после центрифугирования суспендируют в 350 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,7), диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,7).

4Q IV. I хроматография на ДЭАЭ-цел- люло з е.

Диализат от стадии III наносится на колонку с ДЭАЭ-целлкшозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером

45 (рН 7,7), пропускают через колонку, 5 л этого же буфера. Для элюирования КП В ставится градиент: в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,7), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,27 М NaCl. КП А элюируют 1 л 0,005 V трис-HCl буфера (рН 7,7) с 0,27 М NaCl. Объединенные фракции КП В и КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок суспендируют в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,7) и диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,7).

V. Очистка КП В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

30

50

55

Хроматографию проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-HCl буфером (рН 7,7), КП В элюиругст линейным градиентом концентрации NaCl: в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,7) а во втором - 1 л этого же буфера с 0,25 М NaCl. Объединенные фракции КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок растворяют в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,7). Диализуют против 0,005 М трис-HCl буфера (рН 7,7).

Выход 18 мл раствора фермента с удельной активнос1-ью КП В 115 ед/мг белка, выход по активности 25,4%.

VI.Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ целлюлозе.

Фракция КП А от стадии IV наносится на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 Мтрис-HCl буфером (рН 7,7), пропускают 1 л этого же буфера. Потом ставится градиент, в первом сосуде - 1 л 0,005 М трис- HCl буфера (рН 7,7), а во втором - 1 л этого же буфера с 0,3 М NaCl. Объединенные Фракции КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок растворяют в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,7). Диализуют против О ,005 М трис-HCl буфера (рН 7,7).

VII.Кристаллизацию КП А проводят аналогично примеру 1.

Редактор Н.Рогулич

Составитель А.Семенов Техред М.Дидык

Заказ 309

Тираж 482

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Выход 17 мл суспензии фермента с удельной активностью КП А 20 ед/мг белка, выход по активности 27%.

Формула изобретения

Способ получения карбоксипептида- . зы А и карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи, включающий экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, получение осадка, выделение и очистку целевого про- 5 Дукта двукратной ионообменной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, экстракцию проводят 0,005 М буфером трис-HCl с рН 7,5-7,6, полученный экстракт обрабатывают сульфатом аммония при степени насыщения 0,64-0,66 и при рН 7,5-7,6, а ионообменную хроматографию осадка проводят на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,005 М буфере трис-HCl с рН 7,5-7,6 в градиенте концентрации хлорида натрия от О до 0,25-0,26 М для выделения карб- оксипептидаэы В в изокритическом режиме, при концентрации хлорида натрия 0,25-0,26 М для выделения карб- оксипептидаэы А с последующей повторной ионообменной хроматографией выделенных ферментов в тех же условиях.

0

5

0

Корректор Т.Малец

Подписное