СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N9/02 C12N9/04 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам получения ферментов из животного сырья.

Получаемые препараты могут быть использованы для работ в области биохимии, при изучении свойств лактатдегидрогеназы, в области биохимического анализа, для ферментативного определения пирувата и определения активностей аланинаминотрансферазы и аспартатами-нотрансферазы в биологических жидкостях.

Известны различные способы получения лактатдегидрогеназы из микробного сырья [Eur. J. Biochem, v. 130, рр. 321-328, 1983; Methods Enzymol, v. I, рр. 444-448, 1955]. Основным недостатком данных способов является их трудоемкость и многостадийность, а также недостаточный выход целевого продукта, не превышающий 40%. Известны способы получения лактатдегидрогеназы из различных органов животных путем аффинной хроматографии коммерческих препаратов фермента на колонках с иммобилизованными нуклеотидами [Biochim. Biophys. Acta, v. 1297, рр. 235-243, 1996;] Biochim. J., v. 127, рр. 625-631, 1972; Biochem. J. , v. 141, рр. 775-787, 1974] путем очистки из гомогенатов высокоэффективной аффинной хроматографией на иммобилизованном проционовом красителе [J. of Chromatography, v. 266, рр. 151-156, 1983] и путем очистки из цитозоля головного мозга аффинной хроматографией на иммобилизованном колхицине [J. Biochem, v. 107, рр. 138-143, 190].

Недостатком методов аффинной хроматографии является то, что элюцию лактатдегидрогеназы ведут буферами, содержащими нуклеотиды (АМФ, НАДН, АТФ), что сильно удорожает процесс.

Известен способ получения лактатдегидрогеназы из экстракта мышц свиньи путем многократной кристаллизации фермента из раствора, содержащего сульфат аммония со степенью насыщения 0,3-0,5 (30-50%) [Acta-phisiol. Hung, v. 20, рр. 339-346, 1961] . В результате получают высокоочищенный фермент. Недостатками известного способа являются длительность процесса получения лактатдегидрогеназы (около 20 суток) и низкий выход фермента (9,2%).

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ получения лактатдегидрогеназы из грудных мышц птиц [J. Biol. Chem, v. 242, 9, рр. 2151-2167, 1967], включающий следующие последовательные стадии: измельчение сырья, экстракцию 0,1 М Трис-НС1 - 0,001 М ЭДТА, рН 7,2-7,6, центрифугирование осадка, осаждение фермента из надосадочной жидкости 70% сульфатом аммония, фильтрацию, растворение осадка в воде, переосаждение 35% сульфатом аммония, отделение осадка центрифугированием, осаждение фермента из надосадочной жидкости 70% сульфатом аммония, отделение осадка фермента центрифугированием, растворение осадка в воде, диализ раствора фермента против 0,0005 М Трис-HCl, рН 7,6, в течение 16 часов, отделение осадка центрифугированием, хроматографию надосадочной жидкости на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,005 М Трис-HCl, рН 7,6, осаждение фермента 60% сульфатом аммония, отделение осадка центрифугированием, растворение его в воде, диализ против 0,01 М калий фосфата, рН 6,5, в течение 16 часов, хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе, уравновешенной 0,01 М калий фосфатным буфером, рН 6,5, причем фермент элюируют градиентом: 0,01 М калий фосфат, рН 6,5, и 0,2 М NaCl - 0,01 М калий фосфат, рН 6,5. Фермент осаждают 60% сульфатом аммония, осадок фермента центрифугируют, растворяют его в воде, снова центрифугируют и дважды кристаллизуют фермент из раствора сульфата аммония. Процесс кристаллизации длится несколько дней.

В результате получают фермент из грудных мышц страуса с выходом 48% и из грудных мышц утки, фазана и индюшки с выходами не более 26%.

Удельная активность лактатдегидрогеназы из грудных мышц страуса составляет 1850 ед. акт./мг (294 U/мг), а из грудных мышц утки, фазана и индюшки не превышает 1100 ед. акт./мг (177 U/мг).

Недостатками способа-прототипа являются его трудоемкость, многостадийность, длительность и невысокий выход фермента.

Технической задачей изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого фермента.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, выключающим следующие стадии:
1. Измельчение мышц свиньи в мясорубке, экстракцию одним объемом дистиллированной воды в течение 30 минут при температуре 0^oС и центрифугирование.

2. Осаждение фермента сульфатом аммония при 54-56% насыщения, центрифугирование.

3. Растворение осадка в 0,03-0,05 М калий фосфатном буфере, рН 6,0-7,0, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол, и центрифугирование.

4. Диализ раствора фермента против того же буфера.

5. Хроматографию фермента на колонке с сульфопропилсефадексом (SP-сефадексом), уравновешенной 0,03-0,05 М калий фосфатным буфером, рН 6,0-7,0, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол, элюцию калием хлористым, растворенным в том же буфере, при концентрации последнего до 0,13 М.

6. Осаждение лактатдегидрогеназы из раствора сульфатом аммония при 52-55% насыщения, центрифугирование.

7. Растворение осадка в 0,03-0,05 М калий фосфатном буфере, рН 6,0-7,0, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол, центрифугирование.

В результате проведения процесса происходит очистка лактатдегидрогеназы по белку в 20-30 раз, очистка от примесей пируваткиназы в 1000-1500 раз, от примесей аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы - в 50 раз. Удельная активность лактатдегидрогеназы составляет 200-330 U/мг белка, содержание примесей пируваткиназы не превышает 0,04% от активности лактатдегидрогеназы, примесей аспартатаминотрансферазы не более 0,004%, аланинаминотрансферазы - не более 0,007%. Фермент пригоден для использования в наборе для определения аланинаминотрансферазы.

Выход фермента составляет 58-70%. Препараты стабильны в течение 6 месяцев при хранении в виде суспензии в 52-55% сульфате аммония при температуре 4-8^oС.

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
1. Хроматографическую очистку лактатдегидрогеназы проводят на колонке с сульфопропилсефадексом, уравновешенной буферным раствором с рН 6,0-7,0, а элюцию фермента с колонки осуществляют калием хлористым в концентрации от 0,056 до 0,13 М, что позволяет упростить известный способ (в котором предусмотрено две стадии хроматографической очистки фермента сначала на ДЭАЭ-целлюлозе, а затем на карбоксиметилцеллюлозе) и повысить выход и качество целевого продукта. Условия проведения хроматографической очистки фермента являются оптимальными и подобраны экспериментальным путем. Так, при использовании буфера с рН меньше 6,0 возможна инактивация фермента, а при рН буфера более 7,0 не обеспечивается разделение лактатдегидрогеназы от пируваткиназы и балластных белков. Увеличение же концентрации калия хлористого более 0,13 М может привести к ухудшению разделения лактатдегидрогеназы и пируваткиназы.

2. Осаждение лактатдегидрогеназы из надосадочной жидкости после экстракции и из раствора фермента после хроматографии осуществляют сульфатом аммония при конечной концентрации последнего в растворе 52-55%, что позволяет повысить выход и удельную активность фермента; очистка по белку происходит в 2-6 раз, очистка от примесей пируваткиназы в 3-10 раз. Уменьшение концентрации сульфата аммония приводит к уменьшению выхода фермента, а увеличение концентрации - к снижению качества целевого продукта (степень очистки фермента от балластных белков и пируваткиназы снижается).

3. Преимущественно для растворения осадка фермента после осаждения сульфатом аммония, для диализа раствора фермента и для хроматографической очистки последнего используют один и тот же буфер, а именно 0,03-0,05 М калий фосфатный буфер, содержащий 0,5 мМ ЭДТА и 1,5 мМ меркаптоэтанол, что позволяет упростить способ и дополнительно увеличить выход целевого продукта. При концентрации используемого буфера менее 0,03 М может произойти инактивация фермента, а при концентрации буфера более 0,05 М фермент может не сорбироваться на ионообменнике.

Поиск и анализ источников известной научно-технической и патентной информации показал, что заявляемое техническое решение отвечает критериям изобретения "новизна и изобретательский уровень", так как аналогичного способа, имеющего существенные признаки, эквивалентные признакам заявляемого способа, не обнаружено.

Положительный эффект предлагаемого способа получения лактатдегидрогеназы не был очевиден, так как использование SP-сефадекса не описано для очистки лактатдегидрогеназы из какого-либо источника. Состав и свойства компонентов грубо очищенного препарата лактатдегидрогеназы не известны, поэтому невозможно было предвидеть, что при хроматографии на SP-сефадексе и дальнейшем осаждении 52-55% сульфатом аммония произойдет очистка от балластных белков в 20 раз, от примесей пируваткиназы в 1000 раз, а от примесей аспартат- и аланинаминотрансфераз в 50 раз.

Например, при использовании другого катионообменника, карбоксиметилсефадекса (КМ-сефадекс), не произошла очистка от примесей пируваткиназы и других ферментов.

Таким образом, только использование SP-сефадекса в экспериментально подобранных оптимальных условиях хроматографии вкупе с другими отличительными признаками позволяет получить заявляемый технический результат.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами выполнения.

Пример 1
Мышцы свиньи освобождают от сала и измельчают в электрической мясорубке. 1200 г фарша помещают в батарейный стакан, погружают стакан в ледяную баню, приливают 1200 мл охлажденной дистиллированной воды и перемешивают 30 минут механической мешалкой. Смесь центрифугируют при 3000 об./мин 1 час в центрифуге К-80. Надосадочную жидкость собирают, а осадок отбрасывают. Объем надосадочной жидкости 1300 мл. Удельная активность лактатдегидрогеназы 10 U/мг (исходный препарат). Надосадочную жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр и в фильтрат всыпают сульфат аммония до 54% насыщения. Смесь выдерживают на холоде в течение 20 часов и центрифугируют при 3000 об./мин 1 час. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в 300 мл 0,05 М калий фосфатного буфера, рН 6,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол. Раствор осадка центрифугируют при 13000 об./мин 1 час в центрифуге KR-22i (фирма "Jouan", Франция), надосадочную жидкость собирают. Объем надосадочной жидкости около 400 мл. Удельная активность лактатдегидрогеназы 23 U/мг белка.

В надосадочную жидкость всыпают сульфат аммония до 54% насыщения, разливают смесь в полиэтиленовые банки с завинчивающейся крышкой по 25-100 мл и хранят на холоде, при температуре 4-8^oС. Лактатдегидрогеназа в суспензии не теряет активности, по крайней мере, в течение 6 месяцев.

Перед хроматографией аликвоту суспензии (~13 мл) центрифугируют, надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в 12 мл 0,05 М калий фосфатного буфера, рН 6,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол и центрифугируют. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость диализуют против 50 объемов 0,05 М калий фосфатного буфера, рН 6,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол, центрифугируют, осадок отбрасывают, надосадочную жидкость собирают.

11 мл надосадочной жидкости, содержащей 260 мг белка, 8000 U лактатдегидрогеназы и 1600 U пируваткиназы наносят на колонку с SP-сефадексом, уравновешенную 0,05 М калий фосфатным буфером, рН 6,0, содержащим 0,05 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол. Вместимость колонки 500 мл. Промывают колонку 0,056 М калием хлористым, растворенным в буфере для уравновешивания. В 600 мл элюата содержится 160 мг белка (60% от нанесенного на колонку) и только 8% активности лактатдегидрогеназы.

Затем фермент элюируют с колонки градиентом концентраций калия хлористого: 600 мл, 0,06 М КС1, растворенного в буфере для уравновешивания и 600 мл 0,11 М КС1, растворенного в буфере для уравновешивания. Собирают фракции по 20 мл. Фракции, содержащие активность лактатдегидрогеназы, объединяют. Объем объединенных фракций составил 190 мл. В них содержится 40 мг белка, 7400 U лактатдегидрогеназы и 9,5 U пируваткиназы.

В раствор фермента всыпают сульфат аммония до 54% насыщения и оставляют на 20 часов на холоду. Суспензию центрифугируют при 13000 об./мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в 10 мл 0,05 М калий фосфатного буфера, рН 6,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол, и снова центрифугируют. Раствор лактатдегидрогеназы содержал 20 мг белка, 6700 U лактатдегидрогеназы и 1 U пируваткиназы.

Степень очистки по белку по отношению к исходному препарату составила 30, очистка от примесей пируваткиназы произошла в 1600 раз, выход фермента 70%. Удельная активность лактатдегидрогеназы 330 U/мг белка.

Пример 2
Получение фермента проводят аналогично примеру 1, но элюцию лактатдегидрогеназы с SP-сефадекса осуществляют следующим градиентом концентраций калия хлористого: 800 мл 0,06 М КС1, растворенного в 0,05 М калий фосфатном буфере, рН 6,0, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол, и 800 мл 0,12 М КС1, растворенного в том же буфере.

Степень очистки по белку 30, очистка от примесей пируваткиназы в 1000 раз, выход фермента 68%.

Удельная активность лактатдегидрогеназы 300 U/мг.

Пример 3
Получение фермента проводят аналогично примеру 1, но хроматографию лактатдегидрогеназы осуществляют на колонке с SP-сефадексом, уравновешенной 0,03 М калий фосфатным буфером, рН 6,0, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол. Вместимость колонки 1000 мл. На колонку наносят 740 мг белка, 30000 U лактатдегидрогеназы, 5600 U пируваткиназы, 35 U аспартатаминотрансферазы и 70 U аланинаминотрансферазы, а элюцию проводят градиентом концентраций калия хлористого: 1300 мл 0,065 М КС1, растворенного в 0,03 М калий фосфатном буфере, рН 6,0, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол и 1300 мл 0,13 М КС1, растворенного в том же буфере. Осаждали фермент сульфатом аммония при 52% насыщения.

Степень очистки по белку составила 21, очистка от примесей пируваткиназы произошла в 1000 раз, от примесей аспартат- и аланинаминотрансфераз в 50 раз, выход фермента 58%.

Удельная активность лактатдегидрогеназы 211 U/мг белка.

Пример 4
Получение фермента проводят аналогично примеру 1, но элюцию фермента осуществляют 0,06 М КС1, растворенным в 0,05 М калий фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 1,5 мМ меркаптоэтанол. Осаждение фермента проводят сульфатом аммония при 55% насыщения.

Степень очистки по белку 20, очистка от примесей пируваткиназы в 1000 раз, выход фермента 70%.

Удельная активность лактатдегидрогеназы 200 U/мг белка.

Использование предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, позволит:
- сократить количество стадий с 30 до 14;
- сократить длительность процесса;
- повысить выход целевого продукта с 48 до 58-70%;
- повысить качество продукта (продукт, содержит менее 0,04% примесей пируваткиназы и менее 0,007% примесей аспартат- и аланинаминотрансфераз).

Изобретение относится к биотехнологии, может найти применение в биохимии, при определении активностей в биологических жидкостях. Исходное сырье - мышцы свиньи измельчают, суспендируют в 1 объеме воды, центрифугируют. Осаждают фермент 54-56% сульфатом аммония, центрифугируют, осадок фермента растворяют в буфере рН 6,0-7,0. Центрифугируют, диализуют против того же буфера, центрифугируют. Фермент подвергают хроматографической очистке на катионообменнике сульфопропилсефадексе в 0,03-0,05 М калий фосфатном буфере, рН 6,0-7,0 и градиенте концентрации калия хлористого от 0,056 до 0,13 М. Осаждают лактатдегидрогеназу сульфатом аммония при 52-55% насыщения, центрифугируют, осадок фермента растворяют в буфере и хранят в виде суспензии в 52-55% сульфате аммония. Способ позволяет существенно упростить процесс получения фермента, обеспечивает получение высокоочищенной лактатдегидрогеназы с удельной активностью до 330 U/мг белка и выходом до 70%. Препарат содержит не более 0,04% примесей пируваткиназы и не более 0,007% примесей аспартат- и аланинаминотрансфераз. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ получения лактатдегидрогеназы, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию фермента, отделение осадка центрифугированием, осаждение лактатдегидрогеназы из надосадочной жидкости сульфатом аммония, отделение осадка центрифугированием, растворение последнего, диализ раствора фермента, хроматографию на катионообменном сефадексе, осаждение целевого продукта сульфатом аммония, отличающийся тем, что хроматографическую очистку фермента проводят на колонке с сульфопропилсефадексом, уравновешенной буфером с рН 6,0-7,0 с последующей элюцией фермента калием хлористым при концентрации последнего от 0,056 до 0,13 М, а осаждение фермента сульфатом аммония осуществляют при конечной концентрации последнего в растворе, равной 52-55%. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют мышцы свиньи. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию фермента проводят водой при 0^oС в течение 30 мин. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что растворение осадка фермента после осаждения сульфатом аммония, диализ раствора фермента и хроматографическую очистку последнего осуществляют с использованием 0,03-0,05 М калий фосфатного буфера, содержащего 0,5 мМ ЭДТА и 1,5 мМ меркаптоэтанол.