Способ получения карбоксипептидазы А из поджелудочной железы свиньи Советский патент 1989 года по МПК C12N9/48 

Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно карбоксипептидазы А.

Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса.

Изобретение заключается в том, что экстракцию сырья (ацетоновый порошок поджелудочной железы свиньи) проводят 0,005 М трис-НС буфером при рН 7,5-7,6, из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении 0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выделяют белковую фракцию, содержащую целевой продукт, а очистку КПА осуществляют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уразновешен- ной 0,005 М трис-НС буфером при рН

7,5-7,6,и кристаллизуют фермент из воды.

Пример 1.0,7 кг свежезамороженных поджелудочных желез свиньи разрезают на кусочки 4-6 мм и оставляют для автолиза при комнатной температуре на 24 ч. Полученную массу обрабатывают 4 раза ацетоном, затем смесью ацетона и эфира (в соотношении 1:1) и эфиром при интенсивном перемешивании в течение 1 мин, высушивают при комнатной температуре. Полумают l40 г ацетонового порошка.

Ацетоновый порошок перед экстракцией размельчают в лабораторной мельнице. l40 г ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,5 в течение 45 мин на

СП

to

оэ ел

магнитной мешалке при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 60 мин при C. Получают 1300 мл SKCTpaKta. рН экстракта доводят до рН 7,5 с помощью 1 М раствбра NaOH. К экстракту по порциям добавляют сульфат аммония до D,6V насыщенияj п6ддер)кивая рН 7,5 Перемешивают 30 мин. -Выпайшуюбелкойую фракцию отделяют центрифугированием при

6000 об/мин в течение tO мин и 3° С, суспендируют в ЗбО мл 0,05 И трис-ttCl буфера и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,5 до отсутствия сульфата аммония. Осадрк, выпавший во время диализа, отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об /мин и | С и отбрасывают. Центрифугат используют для дальнейшей очистки.V .- ;

;.;/.,.. -, . .--

Хроматография проводится при С. На колонку размером .6x25 см, заполненную ДЭА;Э-целлюлозой, уравйовещеннрй 0,005 М трис-HGl буфером с рН 7,$ /: наносят 40,0 мл раствора белка, полученного на стадии III со скоростью; течения мл/ч. Через колонку пропускдюг 5л 0,005 М трис-HGl буфернрг.6 раствора с рН 7,5 для удаления нёадсорбированных бел кс)в. КПА элюируют линейным градиентом концентрации : в одном сосуде 1 л О,005 М ТРИС-НС1 буфера с рН;,5, в другом 1 л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-rHGl буфере с рН 7,5. Объединяют фракции с удельной активностью КПЛ Ие менее 12 ед/мг белка. К об-ьединеннЫм фракциям с активностью КПА-добав- .Ляют сульфат аммоний; до О,б насыще- ния и перемешивают 30 мин.; Осадок от- деляют центрифугированием в течение 1 .4 при 6QOO обУмин И и растворяют в мл 0,05 И трис-НС1 буфера С рН 7,5 Осадок, выпавший во время диализа, отделяют центрифугированием и выбрасывают. Центрифугат в количестве 50 мл наносят на колонку размером 2, 9x25 см, за пол неннук) ДЭАЭ - целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис- НС буфером с рН 7,5. Скорость течения через колонку мл/ч. Через колонку пропускают 1 л 0,005 М трмс- НС1 буфера с рН 7,5 для удаления побочных продуктов. Карбоксипептидазу А элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1л 0,005 М

трис-ИС1 буфера С рН 7,5, а в другом 1л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,5. Объединяют фракции с удельной активностью- КПА не менее 16 ед/мг белка.

К элюату медленно по порциям добавляют сульфат аммония до 0,6 насыщения и перемешивают 30 мин. Осадок

отделяют центрифугированием при 6000 об /мин в течение 50 мин при С, растворяют в 20 мл 0,05 М трисНС буфера с рН 7,5 и диализуют против 0,005 И трис-НС буфера с рН 7,5.

Осадок отделяют Центрифугированием и выбрасывают.

ПОлуяенный раствор КПА в 0,005 М тр ис-НС буфере с рН 7,5 диализу19т против воды для кристаллизации КПА. Выпавшие Кристаллы промывают Два раза водой, а:$атем растворяют при рН 6,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нёрастворившиеся примеси центрифугированием Лри 150000 об /мин В течение 3 мин. Полученный раствор КПА дйализуюТ: против воды пере кристаллизации КПА В образовавшуюся суспензию кристаллов добавляют толу0ла(0т объема суспензии).

:, Уде льная активность 29,7 ,вд./мг белка; выход по активности 32.

П-р И М ер 2. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1.

T tO г. измельченного ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 М

трис-НСГ/буфера с рН 7,5. Осадок отделяют центрифугированием. Получают 1350 мл экстракта. рН экстракта доводят до 7,55 1 М раствором NaOH. К экстракту на холоду при 40°С

добавля)ют сульфат аммония до 0,65 насыщения при рН до 57,55. После центрифугирования выпавшую белковую фракцию суспендируют в 0,05 Н трис-НС буфере с рН 7,55 и подвергают диализу против 0,005 М трис-ИС1 буфера с рН 7,55 flo Отсутствия сульфата аммония. Диализат от стадии III наносят на Колонку 6x20 см, заполненную ДЭАЭ-цел- люлозой, уравновешенной 0,005 М трисНС буфером 7,55 После отмывки колонки тем же буфером от неадсорбированных белк;ов КПА элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 Н трис-HGl буфера с рН7,55,

а в другом 1 л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 И трис-НС буфере с рН 7,55. Объединяют фракцию с активностью КПА не менее 13 ед./мг белка. КПА из элю

эта осаждают сульфатом аммония при 0,60 насыщении и рН 7,55, осадок отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,55 и освобождают от солей диализом против 0,005 Н трис-НС1 буфера с рН 7,55. Получают мл диализата. Для дальнейшей очистки диализат наносят на колонку 2,9x20 см, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС буфером с рН 7,55. После промывки колонки этим же буфером КПД элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,55, а в другом 1л 0,3 М натрия хлорис- тог.о в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,55. Объединяют фракции, имеющие

активность карбоксипептидазы А не ме- 20 наносят на колонку 2,9x25 см с ДЭАЭ- нее 1б ед./мг белка. Из объединенной целлюлозой, уравновешенной 0,005 М

фракции сульфатом аммония при насыщении 0,65 Н и рН 7,55 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера с рН 7,55 и освобождают от сульфата аммония диализом против 0,005 Н трис-НС буфера.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,55 диализуют против, воды для кристаллизации КПА. Выпавшие в процессе диаЛиза кристаллы промывают два раза водой, а затем растворяют при рН 0,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нера- створившиеся примеси центрифугирова- . нием. Полученный раствор КПА диализуют против воды для перекристаллизации КПА. В образовавшуюся суспензию кристаллов добавляют 4,5 % толуола.

Удельная активность 32,5 ед./мг белка; выход по активности 31,5.

ПримерЗ. Ацетоновый порошок из поджелудочной железы свиньи приготавливают аналогично примеру 1.

г измельченного ацетонового порошка экстрагируют 1400 мл 0,005 i трис-НС буфера 7,6, После центрифугирования получают 140) мл экстракта.

К экстракту при добавляют сульфат аммония до 0,05 насьцденного при рН 7,6. После центрифугирования выпавшую белковую фракцию суспендируют а 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,6 и подвергают диализу против 0,005 И трис-НС буфера с рН 7,6 до отсутствия аммония.

Диализат от стадии III наносят на колонку 6x25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 бу25

30

35

40

45

50

55

трис-НС1 буфером с рН 7,6. Колонку промывают тем же буфером, а элюирова- ние КПА проводят градиентом концентрацией 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,6. Объединяются фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка. Из объединенной фракции сульфат аммония при насыщении 0,66 и рН 7,6 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера рН 7,6, диализуют против 0,005 М трис- НС буфера с рН 7,6 до отсутствия сульфата аммония.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 диализуют против воды для кристаллизации КПА. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды для перекристаллизации КПА. Б полученную суспензию кристаллов добавляют 5 толуола.

Удельная активность КПА 30,2 ед./мг белка; выход по активности 31,8.

П р и М е р 4. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1

140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют l400 мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,4. После центрифугирования получают 1300 мл экстракта.

К экстракту при 4 С добавляют; суль фат аммония до 0,63 насьаиения при рН 7,4, После центрифугирования выпавшую

фером с рН 7,6. После отмывки колонки тем же буфером КПД элюируют линейным градиентом концентраций: в одном сосуде 1 л 0,005 И трис-НС буфера с

рН 7,6, а в другом 1 л 0,3 М ПаС1 в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,5, объединяются фракции с удельной активностью КПД неменее 12 ед./мг. Из

Q полученной фракции КПА, освобожденную от основной массы побочных белков, осаждают сульфатом аммония при 0,66 насьпцении и рН 7,6. Выпавший осадок КПД отделяют центрифугированием, пендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,6 и освобождают от солей диализом против 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,6. Получают 50 мл диализата. Для дальнейшей очистки диализат

5

0

5

0

5

0

5

трис-НС1 буфером с рН 7,6. Колонку промывают тем же буфером, а элюирова- ние КПА проводят градиентом концентрацией 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,6. Объединяются фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка. Из объединенной фракции сульфат аммония при насыщении 0,66 и рН 7,6 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера рН 7,6, диализуют против 0,005 М трис- НС буфера с рН 7,6 до отсутствия сульфата аммония.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 диализуют против воды для кристаллизации КПА. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды для перекристаллизации КПА. Б полученную суспензию кристаллов добавляют 5 то . луола.

Удельная активность КПА 30,2 ед./мг белка; выход по активности 31,8.

П р и М е р 4. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1.

140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют l400 мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,4. После центрифугирования получают 1300 мл экстракта.

К экстракту при 4 С добавляют; сульфат аммония до 0,63 насьаиения при рН 7,4, После центрифугирования выпавшую

белковую фракцию суспендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН Т, и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7, до отсутствия сульфата аммония.

Диализат на стадии III наносят на колонку 6x25 см, заполненную ДЭАЭ- целлюлозой, уравно1вешенной 0,005 М трис-НС1 буфером с рН 7,. После от- Q мывки колонки тем же буфером КПД элюируют линейным градиентом концентрации натрия хлористого 0,3 М в . 0,005 М трис-НС буфере с рН 7, 4. Объединяют фракции с удельной актив- J5 ноетью КПД не менее 12 ед./мг белка. Из полученной объединенной фракции КПД осаждают сульфатом аммония при 0,3 насыщении и рН 7,. Выпавший осадок КПД отделяют центрифугированием, 20 после чего .суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 и освобождают от солей диализом против 0,005 М трис НС буфера с рН 7,. Получают 5 мл диализата.25

Полученный диализат наносят на колонку 2,9x25 см с ДЭДЭ-целлюлозой уравновешенной 0,005 И трис-НС1 буфером с рН 7,. Колонку промывают тем же буфером, а элюйрование КПД зО проводят градиентом концентрации 0,3 М.натрия хлористого в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7Л Объединяются фракции с удельной активностью КПД не менее 1б ед./мг белка.

Из объединенной фракции сульфатом аммония при насыщении 0,63 и рН 7, осаждают КПД. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера с рН 7,, диализуют против 0,005 М трис- дд НС буфера с рН 7, до отсутствия сульфата аммония. ,

Полученный раствор КПД в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7, диализуют против воды для кристаллизации КПД. д Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 и отделяют нерастворйвшиеся примеси центрифугированием. Раствор КПД диализуют против воды для перекристалли- зации КПД. В полученную суспензию кристаллов добавляют 3 толуола.

Удельная активность КПД 20 ед./мг белка, выход 25.

П р и М е р 5. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1,

г измельченного ацетонов;ого порошка экстрагируют мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,7. После цент-

35

0 5

О

д

5

рифугирования получают 1350 мл экстракта.

К экстракту при °С добавляют сульфат аммония до О , 67 насыщения при рН 7,7 После центрифугирования выпавшую белковую фракцию суспендируют в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,7 и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,7 до отсутствия сульфата аммония.

Диализат от стадии III наносят на колонку 6x25 см с ДЭДЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС буфером с рН 7,7. После отмывки колонки тем же буфером КПА элюируют линейным градиентом концентрацией 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-НС буфера рН 7,7. Объединяются фракции с удельной активностью КПД не менее 12 ёд./мг белка.

Из полученной фракции КПД осаждают сульфатом аммония при 0,67 насыщении и рН 7,7. Выпавший осадок КПД отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,7 и освобождают от солей диализом против 0,005 Н трис-НС буфера с рН 7,7. Получают 52 мл диализата.

Для дальнейшей очистки диализат наносят На колонку 2,9x25 см с ДЭАЭ- целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС буфером с рН 7,7. Колонку промывают тем же буфером, а элюйрование КПД проводят линейным градиентом концентрацией 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,7. Объединяют фракции с удельной активностью КПД не менее 1б ед./мг белка.

Из объединенной фракции сульфатом аммония при насыщении О,б7 и рН 7,7 осаждают КПД. Осадок суспендируют в 20 мл 0,005 Н трис-НС буфера с рН 7,7 и диализуют против 0,005 М трис- НС буфера с рН 7,7 до отсутствия сульфата аммония.

Полученный раствор КПД в 0,005 М трис-буфере с рН 7,7 диализуют против ВОДЫ кристаллизацией КПД. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 и отде - ляют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Полученный раствор КПД диализуют против воды для перекристаллизации. 8 полученную суспензию кристаллов КПД добавляют 6% толуола.

Удельная активность КПД 22,6 ед./мг белка; выход 28,1%.

Таким образом, технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в улучшении качества ферментного препарата карбоксипептидазы А, применяемой в белковой химии для структурных исследований, а также в упрощении технологического процесса за смет сокращения числа стадий.

Формула изобретения

Способ получения карбоксипептидазы А из поджелудочной железы свиньи, включашчий экстракцию ацетонового порошка трис-НС1 буфером, осаждение

фермента сульфатом аммония, двукратную ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,005 М трис-НС1 буфере с градиентной элюцией хлористым натрием и последующей кристаллизацией из воды, о т л и ч а ю щ.и и - с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и упрощения процесса, экстракцию, осаждение фермента и хроматографию ведут в 0,005 М трис-НС буфере рН 7,5-7,6, осаждение проводят при насыщении сульфата аммония 0,64-0,66, а элюцию с ДЭАЭ-целлюлозы ведут градиентом хлористого натрия 0-0,30 М.

Изобретение относится к способу получения ферментного препарата карбоксипептидазы A (КПА) из поджелудочной железы свиньи, применяемого в белковой химии для структурных исследований. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса. КПА получают экстракцией сырья 0,005 М трис-HCL буфером при рН 7,5-7,6. Из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении 0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выделяют белковую фракцию, содержащую целевой продукт. Очистку КПА осуществляют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,005 М трис-HCL буфером при рН 7,5-7,6. Кристаллизуют из воды. Удельная активность КПА 29,7-32,5 ед/мг белка. Выход по активности 31,5-32%.