Способ подготовки биологического материала для иммуноферментного анализа на СПИД Советский патент 1991 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к области медицины, в частности к области иммунологии, и может быть использовано для диагностики СПИД.

Целью изобретения является повышение специфической активности биоматериала.

Способ осуществляется следующим образом.

Забор биоматериала (крови) осуществляется из пальца, после чего пробу цельной капиллярной крови наносят на твердофазный носитель и высушивают при комнатной температуре.

Пример 1. У обследуемой Т.Л- берут 3 мл крови из вены, центрифугируют при 3000 об/мин для получения сыворотки, после чего сыворотку хранят при до момента исследования в ИФА с помощью тест-системы предприятия Антиген (СССР). На следующие сутки 10 мкл сыворотки вносят в лунку пленшета для иммунологических реакций, в два этапа растворяют в жидкости, находящейся в комплекте тест-системы до разведения 1:100 и исследуют на наличие антител к ВИЧ в соответствии с инструкцией к текст- системе. При спектрофотометрической оценке результатов ИФА величина экс- тинкции составляет t,287, что свидетельствует о высокой, вероятности наличия у обследуемой СПИД (экстинкция отрицательного контроля 0,229). При контрольном двукратном (в соответствии с вышеуказанной Инструкцией... МЗ СССР) исследования сыворотки,хранившейся при+4 С, установлено наличие антител к ВИЧ (подтвержденное в дальнейшем в ходе экспертного анализа методом вестерн-блот), Характерно, что уровень антител к ВИЧ в сыворотсл

2

У1

ке крови прогрессивно снижается по мере хранения при при втором исследовании экстинкция составляет 1,01й, при третьем, выполненном на следующие сутки после второго, 0,803. (экстинкции отрицательного контроля 0,119 и 0, соответственно).

У три же обследуемой из пальца берут три порции крови по 0,02 мл, вносят в три лунки планшета для иммунологических реакций и высушивают при комнатной температуре в течение 1 ч. В лаборатории в одну из лунок вносят 0,1 мл растворяющей жидкости из комплекта тест-системы предприятия Антиген и далее исследуют на наличие антител к ВИЧ в соответствии с инструкцией к тест-системе, Спек- трофотометрическая оценка результатов анализа показывает высокую вероятность наличия СПИД у обследуемой (экстинкция составляет 1,256, в отрицательном контроле 0,159). Двукратное контрольное исследование выполняют, используя две оставшиеся пробы высушенной с интервалом в 1 сут. Результаты анализа подтверждают наличие антител к ВИЧ в цельной капиллярной крови (экстинкции 1, и 1,22, отрицательный контроль 0,253 и 0, соответственно). При хранении проб высушенной крови на протяжении 2 сут содержание в ней антител к ВИЧ остается практически постоянным, о чем свидетельствует динамика величин экстинкции.

Таким образом, сравнимые результаты анализа сыворотки и капиллярной

5

ляет 1,163, что свидетельствует о высокой вероятности наличия у обследуемого СПИД (экстинкция отрицательного контроля ). Однако при контрольном двукратном исследовании сыворотки, хранившейся при С, с интервалом в 1 сут величины составля ет (экстинкции) 0,219 и 0,187 соответственно (в отрицательном контроле 0,210 и 0.15М, что указывает .на отсутствие антител к ВИЧ в анализируемой сыворотке (подтвержденное в последующем в реакции иммуноблотин- га) и, следовательно, на ложноположм- тельный результат первого анализа.

У того же обследованного из пальца берут три порции крови по 0,02 мл, вносят в три лунки планшета для иммунологических реакций и высушивают при комнатной температуре в течение 1 ч. В лаборатории в каждую из лунок вносят по 0,1 мл растворяющей жидкости из комплекта тест-системы и далее исследуют на наличие антител к ВИЧ в соответствии с инструкцией к тест-системе. Спектрофотометрическая оценка результатов анализа показала отсутствие антител к СПИД в пробах Q крови (экстинкции составили 0,, 0,229 и 0,258 соответственно, в отрицательном контроле 0,200).

Следовательно при анализе высушенных проб капиллярной крови ложнопопо- жительный результат не установлен.

Доказательство получения положительного эффекта.

1. Анализ чувствительности иммуно- ферментного выявления антител к ВИЧ

0

5

5

Изобретение относится к области медицины, в частности к области иммунологии, и может быть использовано при подготовке бис/материала для диагностики СПИДа. Цель - повышение специфической активности биоматериала. У больного из пальца берут кровь, помещают в отдельную лунку 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа, высушивают при комнатной температуре. Способ позволяет повысить специфическую активность биоматериа- лэ и уменьшить количество ложнеположительных реакций .в 9 раз, а кроме того, сохранить активность а течение 5 сут. 8 Л

крови, содержащих антитела к ВИЧ, ука-дд при подготовке пробы по заявленному

способу и способу-прототипу в соот-, ветствующем биологическом материале 25 носителей вируса СПИД показал,что антитела к ВИЧ обнаружены в каждой 45 пробе высушенной крови. Это свидетел ствует о том, что подготовка проб би материала по предлагаемому способу не приводит к уменьшению чувствитель ности процедуры выявления в нем анти

зывают на отсутствие ложноотрицатель- ных результатов при исследовании капиллярной крови.

Пример 2.У обследуемого В.И. берут 3 мл крови из вены, центрифугируют при 3000 об/мин, для получения сыворотки, после чего сыворотку хранят при. до момента исследования в ИФА с помощью тестспособу и способу-прототипу в соот-, ветствующем биологическом материале 25 носителей вируса СПИД показал,что антитела к ВИЧ обнаружены в каждой 45 пробе высушенной крови. Это свидетельствует о том, что подготовка проб биоматериала по предлагаемому способу не приводит к уменьшению чувствительности процедуры выявления в нем анти- ,

системы предприятия Антиген. На еле- .Q тел к ВИЧ.

дующие сутки 0,02 мл сыворотки вносят2. Определение специфичности анализа при подготовке проб биоматериала по предлагаемому способу и способу- прототипу осуществляют путем исследования сыворотки венозной крови и высушенных проб капиллярной крови 1Й5 обследованных доноров крови. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице.

в лунку планшета для иммунологических реакций, растворяют в жидкости, находящейся в комплекте тест-системы, до разведения 1:100 и исследуют на наличие ВИЧ в соответствии с инструкцией к тест-системе. При спею трофотометрмческой оценке результатов ИФА величина экстинкции состав55

при подготовке пробы по заявленному

способу и способу-прототипу в соот-, ветствующем биологическом материале 25 носителей вируса СПИД показал,что антитела к ВИЧ обнаружены в каждой пробе высушенной крови. Это свидетельствует о том, что подготовка проб биоматериала по предлагаемому способу не приводит к уменьшению чувствительности процедуры выявления в нем анти- ,

515545926

Количество и доля ложнеположительных реакций в ИФА при использовании различных способов подготовки биоматериала

Анализируемый материал

Сыворотка венозной крови (способ- прототип)1Й5

Высушенная капиллярная

кровь (предлагаемый

способ)1120

Из данных таблицы следуе т, что использование заявляемого способа подготовки проб позволяет снизить количество ложнеположительных результатов ИФА в 7,6 раза по сравнению со способом-прототипом (р 0,001).

Применение предлагаемого способа позволяет добиться еще одного важного положительного результата: возможности хранения проб биоматериала при комнатной температуре как минимум до «5 сут.

Таким образом, использование описываемого способа подготовки биоматериала позволяет получить положительный эффект - повышение специфической активности биоматериала, которое заключается: 1) в значительном уменыиеКоличество I Количество ложнополо- пробI жительных результатов,%

219 (18,8)

28 (2,5)

нии количества ложноположительных результатов анализа и 2) в обеспечении сохранности специфических антител в условиях, не требующих специальной рефрижераторной техники на протяжении как минимум сут.

Формула изобретения4

Способ подготовки биологического материала для иммуноферментного аиа- лиза на СПИД путем забора материала и предварительной его обработки, о т- личающийся тем, что, с целью повышения специфической активности биоматериала, используют цельную кровь, причем перед анализом наносит

ее на твердую фазу и высушивают при комнатной температуре.