Тест-система для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА.

По-прежнему ящур распространен в мире и причиняет значительный экономический ущерб. Возбудителем данного заболевания является РНК(+)-содержащий вирус порядка Picornavirales семейства Picornaviridae рода Aphthovirus с длиной нуклеиновой кислоты около 8500 н.о. [1, 2]. При репродукции вируса ящура в биологических системах формируются 146S компонент (полные частицы, основной иммуногенный компонент), состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁-VP₂-VP₃-VP₄ [1].

Существует 7 серотипов ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [2]. В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Антитела против одного серотипа не обеспечивают иммунную защиту против другого серотипа и даже многих других генетических линий [3, 4].

В геноме вируса ящура в процессе репродукции и смены хозяина возникают мутации, что приводит к появлению новых генотипов [5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [7].

Наиболее вариабельным считается поверхностный протеин VP₁ вируса ящура. Его самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [5, 7]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [8, 9, 10].

Для вируса ящура серотипа SAT-2 характерна генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 14 топотипов (I-XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура и проведение ретроспективного анализа. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2.

Вспышки ящура серотипа SAT-2 регистрируются на территории Африканского континента. Преимущественно эпизоотическая ситуация связана с генотипами SAT-2/IV/Alx-12 и SAT-2/IV/Lib-12, которые распространены в странах Северной Африки, в частности, в Египте, где вспышки отмечали в период с 2012 по 2022 гг.и Либии (2012 г.). На территории Западной Африки, в частности в Камеруне (2014 г. ), Нигерии (2019-2021 гг.), также преимущественно распространены изоляты вируса ящура генотипов SAT-2/IV/Alx-12 и SAT-2/IV/Lib-12. Соответственно, в указанных странах проводились мероприятия по ликвидации и борьбе с ящуром указанных генотипов.

При этом постепенно с 2012 г. в странах Африканского континента и преимущественно на Востоке материка (Бурунди, Кения, Танзания и другие страны) стали появляться изоляты вируса ящура нового топотипа IV. Так, в Кении уже в 2012 и 2013 гг. выделили представителей генотипа SAT-2/IV, далее в Танзании в 2013 г. была сильная вспышка, вызванная вирусом данного варианта. В 2017 г. сложная эпизоотическая ситуация по ящуру генотипа SAT-2/IV отмечали в Кении, в 2020 г. - в Уганде, в 2022 г. - в Бурунди. Прогнозы экспертов неутешительны в отношении распространения данного варианта вируса ящура. Следует отметить, что имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации и других стран.

Степень изменчивости внутри одного топотипа IV высокая, поэтому возникает острая необходимость в изучении свойств появляющихся штаммов вируса ящура и изготовления на его основе вакцинных препаратов и диагностических тест-систем [11, 12, 13].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа SAT-2, которые используются при производстве средств специфической профилактики ящура и при ретроспективной диагностике:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/9») (генотип SAT-2/XIV).

Изолят «SAT-2/KEN/19/2017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории населенного пункта Rongai в регионе Nakuru Республики Кения в 2017 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2022 г.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу IV серотипа SAT-2 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-2, в том числе штамма «SAT-2/ETH/l/90» (генотип SAT-2/IV).

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH и получен штамм «SAT-2/Кения/19/2017» (генотип SAT-2/IV). Данный штамм был депонирован Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №452 - деп / 23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура представлена на фиг. 3.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (1000 повторов), показан рядом с ветвями. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 16 нуклеотидных последовательностей. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 642 позиции. Эволюционный анализ проводился в MEGA 7.

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Африки и Ближнего Востока, вероятность риска заноса ящура на территорию нашей страны является очень высокой. Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с распространения в мире генотипа SAT-2/IV вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного генотипа. В результате возникла необходимость создания диагностической тест-системы для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА.

Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [14-19]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к 146S частицам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). РМН считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 72 часов), 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, СО₂-инкубатора, 3) использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня BSL-3.

В свою очередь, ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [20]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для исследования уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.

В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. Особое внимание уделяют жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ: 1) данный анализ максимально приближен к классической РМН, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как в наиболее естественных условиях; 2) эпитопы на поверхности вириона наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.

На мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа SAT-2 - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [21]. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2017 года (период, когда появился производственный штамм «SAT-2/Кения/19/2017») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа SAT-2/IV ниже 25%, что подтверждают данные РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа SAT-2 [22].

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением. Компонент 3 - Буфер для разведения (5х). Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа SAT-2, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана была еще в конце 90-гг XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов серотипа SAT-2. Изоляты и штаммы генотипа SAT-2/IV имеют существенные отличия от других линий серотипа SAT-2. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура генотипа SAT-2/IV. Данная тест-система выявляет антитела к данному генотипу не более, чем на 28%. Исходя из этого, требуется разработать чувствительную, специфичную тест-систему для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма удалена от РМН относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным вариантом ИФА.

Учитывая указанные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе наиболее близкого прототипа, для точного определения титра антител против вируса ящура генотипа SAT-2/IV, актуальной является разработка тест-системы для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА с учетом выше приведенных недостатков.

На сегодняшний день с помощью жидкофазного блокирующего «сэндвич»-варианта ИФА с особенностями проведения реакции и определенным составом компонентов реакции разработаны «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации», «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации» и «Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА» [23-25].

В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью определять титр антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV в сыворотках крови животных.

Целью изобретения является создание тест-системы для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный 146S компонент вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV;

2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV;

3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV;

4) контроль 1 (сильноположительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к 146S частицам вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV с процентом ингибиции 80-100%;

5) контроль 2 (положительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к 146S частицам вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV с процентом ингибиции от 50,0% до 79,9%;

6) контроль 3 (отрицательный контроль) - сыворотка крови телят, не содержащая антитела к антигену вируса ящура;

7) блокирующая сыворотка крови;

8) антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).

Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,5-9,7), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор SDS.

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции микронейтрализации в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против вируса ящура того же генотипа. Сенсибилизированные лунки обрабатывают с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке чувствительной и специфичной против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV тест-системы, предназначенной для определения титра антител против указанного антигена методом жидкофазного ИФА на основе применения 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV и при получении иммуноспецифических компонентов реакции.

В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 600 раз инактивированный 146S компонент вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV, который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность определять титр антител против вируса ящура указанного генотипа с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что на 72% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент с протектором (2,4% хлорида натрия) остается стабильным не менее 4 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного 146S компонента вируса ящура генотипа SAT-2/IV составляет 1:5000.

В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела лабораторных животных, соответственно, высокоспецифичные по отношению к 146S частицам вируса ящура генотипа SAT-2/IV. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против генотипа SAT-2/IV вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента с протектором (2,4% хлорида натрия), что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 4 лет и с активностью не менее 1:10000 и 1:5000, соответственно.

В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, сильноположительный и положительный контроли получены против высокоочищенного концентрированного инактивированного 146S компонента вируса ящура генотипа SAT-2/IV, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофильно высушенных суспензий, что позволяет хранить их не менее 4 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:6000, для контроля 2 - не менее 1:6000.

В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде с протектором (2,4% хлорида натрия), что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 4 лет.

В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям экстинкции и титру антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяются антитела кроличьи к иммуноглобулину G морской свинки H&L (HRP), что позволяет повышать специфичность анализа и получать более достоверные результаты определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:4000.

Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносят в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV. Наличие антител к 146S частицам вируса ящура данного генотипа в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против иммуноглобулинов G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количественному значению выявленного титра антител животного. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Седиментационный профиль 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV.

Фиг. 2 - Электрофореграмма для 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV в 12% полиакриламидном геле. Примечание: М - маркер белковый, 2-6 - номера фракций, которые соответствуют седиментационному профилю 146S частиц.

Фиг. 3 - Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура генотипу SAT-2/IV.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура.

На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV, иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объема деионизированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,5-9,7.

Раствор №2 (Wash-раствор). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% Tween-20 с водородным показателем 7,5-7,7. Рабочий Wash-раствор готовят разведением концентрата в 20 раз.

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего Wash-раствора с добавлением 10% фетальной сыворотки телят.

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма SAT-2/Кения/19/2017 генотипа SAT-2/IV представлены ниже.

1. Иммобилизация сенсибилизирующих антител против 146S частиц вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV готовят в разведении 1:10000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18 ч при температуре (2-4)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Wash-раствора 2 раза.

3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5;9,0; 10,0; 11,0; 12,0; 13,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:8192) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1. Положительной сыворотка считается при уровне гуморального иммунитета ≥5,0 log₂SN₅₀ (≥1:32).

В качестве контроля 1 используют сильноположительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV - процент ингибиции (PI) 80-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV - PI=50,0-79,9%, контроля 3 - нормальную сыворотку КРС/свиней - процент ингибиции <50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:3000. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-4)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые сенсибилизированные лунки планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и 146S частиц, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см³ раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ диаммониевой соли 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), закрывают крышкой и выдерживают 15 минут при температуре (20±2)°С.

11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 0,5%-ного раствора SDS.

12. Определение значения экстинкции и титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV по данным ИФА. Сразу после остановки реакции измеряют значение декадного коэффициента экстинкции (ε) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения г переводят в значение процента ингибиции (PI, %) по формуле:

PI (%)=(1-(ε_{сыворотки}-ε_КК)(ε_КА-ε_КК))×100,

где, ε_{cыворотки} - среднее значение декадного коэффициента экстинкции смеси сыворотки с инактивированным 146S компонентом вируса ящура генотипа SAT-2/IV;

ε_КА - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля антигена;

ε_КК - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля конъюгата.

Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:

- разница между значениями ε_КА и ε_КК не менее 0,45 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение PI>80%;

- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50,0-79,9%;

- контроль 3 имеет значение PI<50%.

Сыворотки крови, для которых значение PI≥50%, считают положительными, содержащими антитела к 146S частицам вируса ящура генотипа SAT-2/IV. Значение PI<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV и выражают в log₂SN₅₀.

В результате проведенных исследований были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:5000, сенсибилизирующих антител - 1:10000, антивидового конъюгата - 1:4000; 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV - 1:5000, контроля 1-1:6000, контроля 2 - 1:6000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV и проведен сравнительный анализ с результатами РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0; 13,0 log₂SN₅₀ (1:16-1:8192).

Контроль суспензий 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV на специфичность.

Специфичность суспензий 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP₁, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «SAT-2/Кения/19/2017» к генотипу SAT-2/IV. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» составила 2,25 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 1,49 мкг/мл (66%). Данное содержание полных вирусных частиц (146S компонент) достаточно для проведения дальнейших работ по концентрированию и получению готового лиофильно высушенного антигена для изготовления тест-системы.

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура серотипа SAT-2 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 24-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку. Она состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой и не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена, кодирующего белок VP₁, штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-1/IV (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура изучено в РМН в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/Кения/19/2017» составили r₁ от 0,02 до 0,25, а именно для штамма «SAT-2/ZIM/14/2002» (генотип SAT-2/I) - 0,23, для «SAT-2/ZIM/5/81» (генотип SAT-2/II) - 0,21, для «SAT-2/BOT/P3/98» (генотип SAT-2/III) - 0,22, для «SAT-2/ЕТН/1/90» (генотип SAT-2/IV) - 0,25, для «SAT-2/GHA/2/90» (генотип SAT-2/V) - 0,19, для «SAT-2/GAM/8/79» (генотип SAT-2/VI) - 0,15, для «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII) - 0,10, для «SAT-2/RWO/1/00» (генотип SAT-2/VIII) - 0,14, для «SAT-2/KEN/2/84» (генотип SAT-2/IX) - 0,09, для «SAT-2/UGA/19/98» (генотип SAT-2/X) - 0,06, для «SAT-2/ANG/4/74» (генотип SAT-2/XI) - 0,18, для «SAT-2/UGA/51/75» (генотип SAT-2/XII) - 0,02, для «SAT-2/ЕТН/2/2007» (генотип SAT-2/XIII) - 0,13, для «SAT-2/ETH/2/9»1 (генотип SAT-2/XIV)-0,12.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2. Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,44 г/см³. Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,3°С).

Дополнительные признаки и свойства инактивированной суспензии 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» морским свинкам, кроликам, свиньям, овцам, КРС индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - инактивированный вируса ящура указанного штамма не патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - инактивированный вируса ящура указанного штамма не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность неинактивированного вируса ящура - сохраняет исходные биологические свойства при культивировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение суспензии 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

Для получения суспензии 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV для изготовления тест-системы проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 13-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли полигексаметиленгуанидином.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 2-4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее ПЭГ-6000 до конечной концентрации 8,5% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе, концентрируя в 600 раз (1/600 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017». Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На следующем этапе проводили получение 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017», необходимого для иммунизации животных и получения антигена как одного из важнейших специфических компонентов ИФА.

Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 40 и 30%. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 40-30%-м слое сахарозы, которые отбирали и переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV в виде антигенного профиля представлены на фиг.1. Проведен электрофорез 146S частиц в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг.2), который подтвердил, что для исследований подходят по степени чистоты фракции №№2-6.

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

Для получения специфических сывороток крови против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV использовали клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли инактивированную суспензию 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV, полученную как описано в примере 1, из которой готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген=60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (2-4)°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию из 146S частиц вируса ящура генотипа, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности в ИФА суспензии 146S частиц вируса ящура генотипа, сенсибилизирующих и детекторных антител к нему.

Полученные образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном варианте ИФА. Проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:8000, 1:9000, 1:10000, 1:11000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:5000, для детекторных антител - 1:5000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂SN₅₀. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:10000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:5000, для сенсибилизирующих антител - 1:10000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂SN₅₀. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:5000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Для анализа исследовали следующие разведения 146S частиц: 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:5000, для сенсибилизирующих антител - 1:10000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂SN₅₀. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:5000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Таким образом, в ходе лабораторных испытаний определено, что рабочие разведения 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV, сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:5000, 1:10000, 1:5000, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного варианта ИФА для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV (предлагаемое изобретение).

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными моновалентными вакцинами против ящура, содержащими 146S частицы вируса ящура генотипа SAT-2/IV. Определены значения титра антител против 146S частиц с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА (предлагаемое изобретение).

Для исследования представленной тест-системы для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 410 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находился в диапазоне 5,5-13,0 log₂SN₅₀. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 410 образцов сывороток крови 407 определены в качестве положительных, а 3 - в качестве отрицательных (титр антител по данным ИФА составил 1:16). Для исследования специфичности метода тестировали 205 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 205 отрицательных проб - 205 определены в качестве отрицательных. Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 97,89-99,85%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,22-100,0%, k-критерий - 0,989; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 95,84-99,70%, общая точность (DAc) - 98,59-99,90% (таблица 6).

Таким образом предлагаемая «Тест-система для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей в течение 4 часов провести анализ сывороток крови животных с определением титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV. Данный генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента. Разработанная тест-система направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного генотипа, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА»:

1. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R. [et al.] // World J Virology. - 2015. - V. 4(3). - P. 295-302.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.

3. Гуленкин, B.M. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.

4. Brooksby, J.В. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18:1-23.

5. Rueckert, R.R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959,

6. Grubman, M. J. 1980. The 5' end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp.Arch. Virol. 63:311-315.

7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, С.M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J.I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91:47-63.

8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.

9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.

10. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.K., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.

11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.

12. King, A.M., D. McCahon, K. Saunders, J.W. Newman, and W.R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.

13. Tosh, C., D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.

14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/

15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP₀ cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.

19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.

20. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

21. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_uploaod/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis_Brocchi_.pdf (Дата обращения: 05.04.2023).

22. Наборы для определения антител к антигену вируса ящура (FMDV) PrioCHECK. URL: vetprofilab.ru/f/rus_priochek_fmdv.pdf (Дата обращения: 24.03.2023).

23. Патент РФ №2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022108324.

24. Патент РФ №2791614, 13.03.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022119118.

25. Патент РФ №2796393, 23.05.2023. Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка №2022113420.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="ELISA FMDV SAT-2

IV.xmp.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-06-19">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-19</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>515</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-19</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для определения титра

антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью

жидкофазного ИФА</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>642</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..642</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accactagtgctggagagggagcagacgtcgtcacgactgacccctcaa

cacacggtgggagtgtagtggagaagagacggatgcacacagacgttgcattcgtgctggacaggttcac

tcacgtacacaccaacaaaaccacatttaacgtggacctactggacaccaaacaacaaaccttagtgggt

gctcttctcagagcgtcaacctactacttctgtgacttggagattgcctgtgtgggcaaccacaaacgcg

tctactggcagcccaacggcgcgccacgtacgacgcaactgggagacaaccccatggtgttcgcccacaa

cagcgtcactaggtttgccataccttacaccgcaccgcaccggttgcttgcaaccgtgtacaacggcgag

tgtaagtacacagaacgagttcccgcaatccgcggtgaccgtgctgtgttggcagccaagtacgccaact

ccagacacacgcttccatccacgttcaactttggacacgtgaccgccgacgagccagtcgacgtttacta

caggatgaagcgggcagagttgtattgtccaaggccactcctcccggcttaccaacacaacgaccgggac

aggttcgacgcacccattggcgtcgagaaacaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>214</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..214</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTTDPSTHGGSVVEKRRMHTDVAFVLDRFTHVHTNKTTF

NVDLLDTKQQTLVGALLRASTYYFCDLEIACVGNHKRVYWQPNGAPRTTQLGDNPMVFAHNSVTRFAIPY

TAPHRLLATVYNGECKYTERVPAIRGDRAVLAAKYANSRHTLPSTFNFGHVTADEPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYQHNDRDRFDAPIGVEKQ</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА. Технический результат заключается в разработке чувствительной и специфичной против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV тест-системы, предназначенной для определения титра антител против указанного антигена методом жидкофазного ИФА. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Тест-система для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА, содержащая:

- иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: инактивированные 146S частицы вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV с активностью в ИФА 1:5000; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV с активностью в ИФА 1:10000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV с активностью в ИФА 1:5000; контроль 1 - сильноположительная сыворотка крови телят против 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV с процентом ингибиции 80-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят против 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV с процентом ингибиции от 50% до 79,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антител к антигену вирусу ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:4000;

- неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,7, 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор SDS, отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса ящура содержит инактивированные 146S частицы вирус ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV; и для определения процента ингибиции используются значения декадного коэффициента экстинкции и математическая формула: PI, % =(1-(ε_{сыворотки}-ε_КК)/(ε_КА-ε_КК))×100, при этом титр антител против 146S частиц вируса ящура определяется как максимальное разведение сыворотки крови, для которой значение процента ингибиции составляет ≥50%.

2. Тест-система по п. 1, являющаяся специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4 часов определить титр антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV в широком диапазоне 1:16-1:8192, или 4,0-13,0 log₂SN₅₀.