Штамм бактерий RнIZовIUм Sp. (ОNовRYснIS) для производства удобрения под эспарцет Советский патент 1992 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых растений,

Известен штамм Rhizoblum sp. (Onobrychis)820, который используется для инокуляции эспарцета. Однако его азотфик- сирующая активность и технологичность недостаточно высоки и стабильны. Кроме того, прибавки урожая, особенно в южной степной части СССР незначительны.

Целью изобретения является.создание штамма клубеньковых бактерий эспарцета, отвечающего требованиям производства ризоторфина, обладающего более высокой активностью азотфиксации и повышающего и улучшающего качество урожая эспарцета. В качестве такого штамма предлагается штамм 2921.

Клубеньковые бактерии шт2921 выделены из клубеньков эспарцета в 1985 году

Штамм определен по определителю Берги.

Штамм Rhizobium sp (Onobrychis) 2921 депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 2921.

Штамм 2921 растет на питательных средах следующего состава1

1.Гороховый агар, г/л горох - 100 0 сахароза - 20,0; агар - 20,0, рН 7,0-7,2

2.Жидкая среда Норриса г/л К2НРО/1 0,5; MgS04-7H20 - 0,8, РеС1з - 0 01 ман- нит - 10,0, дрожжевой экстракт - 100 мл

рН7,1.

Морфолого-культуральные свойства Вегетативные клетки

00

На гороховом агаре с рН 7,1-7,2 при 28- 30°С в шестисуточной культуре имеют форму палочек размером 1-2,8-0,6-0,7 мкм, грамотрицательные, тип жгутования - пе- ритрихи. В молодых культурах подвижны, гомогенны, при старении гбмЪгённость сменяется зернистостью с одновременной утратой пШвижно сти. При старении кул|ту$ы образуют бактероиды, пред- стафякудие $рЪой крупные колбообраз- н ы е : л ет ки, .J

Характеристика роста на плотной среде.

Гороховый агар, Т 28-30°С, рН 7,0-7,2

Колонии появляются на шестые сутки, слизистые, полупрозрачные, выпуклые, круглые, иногда неправильной формы, до 2 мм в диаметре.

Рост на углеводных средах обычно сопровождается образованием обильной внеклеточной полисахаридной слизи.

Физиолого-биохимические свойства.

Симбионт.

Макросимбионт - бобовое растение эспарцет.

Отношение кг

а)кислороду - аэроб

б)Т° максимальная 40°С

минимальная10°С

оптимальная - 27-29°С

в)рН максимальный 7,5

минимальный 6,0 оптимальный . 7,0-7,2

9е

ГлюкозаАщ(-)

ЛактозаАщ(-)

МальтозаАщ(-)

КсилозаАщ(-)

СахарозаАщ(-)

РамнозаАщ(-)

МаннитАщ(-)

СорбитАщ(-)

Клетчатка-

Крахмал

Жидкая среда Норриса, Т 26-28°С Источники азота

Ж NaNOa

(NH4)2$04

тирозин

МПА

Азот фиксирует в симбиозе с эсп арце- ом.

Другие характерные физиологические собенности.

Желатину не разжижает.

+ + +

Молоко с лакмусом не пептонизирует, подщелачивает, образуя слизистую зону на поверхности.

Содержание Г+ Ц в ДНК 62,3%.

Штамм не патогенен. Штамм 2921 хранится на гороховом агаре указанного выше состава при 2-4°С в течение 6 месяцев, затем пересевается.

П р и м е р 1. Технология приготовления

препарата на основе штамма 2921.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или пятилитровых бутылях в течение 4 суток на среде следующего состава, мас.%: гороховый отвар - 10,0; сахар (пищевой) - 1,0: (МНфЗСм - 0,05; КН2Р04 - 0,05; К2НРСМ-ЗН20 - 0,05; MgSCM 7H20-0,02; СаСО 3-0,1; вода водопроводная-до 100,0. рН после стерилизации (1,0 эти, 30 мин.) - 6,8-7,0. Титр

клеток 3-4 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят1 в пятилитровых бутылях или ферментерах на среде следующего состава, мас.%: кукурузный

экстракт - 1,0; меласса - 2,0; (МН4)25См - 0.1: КН2Р04 - 0,025; КаНРСм-ЗНаО - 0,025; Мд5См-7Н20-0,02; СаСОз- 0,1; вода водопроводная до 100,0. рН после стерилизации 6,8-7,0.

Бутыли и ферментеры засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутыли встряхивают на качалке в течение 80-96 часов. В ферм енте- рах бактерии выращивают 36-48 часов при

аэрации 0,7-1,5 об/ге.ин под избыточным давлением 0,3-0,5 эти при температуре 28-30°С, Титр 4-5 млрд/мд. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей или ферментеров инокулюм - используют для смешивания с торфом. Подготовка торфа.

Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рЫ 6,8-7,0 с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200400 г стерилизуют гамма-облучениТзм при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси куль- туральной жидкости с мелассой (6%) из расчета исходного титра бактерий в торфе

0,3-0,5 млрд/г торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в. торфе подращивают, выдерживая пакеты

3-5 суток при температуре 15-20°С. Ри- зоторфин хранят при температуре 3-8°С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов. Характеристика готового продукта.

Ризоторфин на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризотор- фин содержит 5-10 млрд клубеньковых бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 месяцев со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

Пример 2. Сравнительное изучение штаммов Rhlzobtum sp.(0nobrychls) 820 и 2921 было проведено в вегетационных и деляночных опытах с эспарцетом сорта Южноукраинский. В вегетационных опы- тах использовали темно-каштановую почву, содержащую легкогидролизуемого азота 2,7 мг на 100 г почвы. Навеска почвы в сосудах 6 кг. Повторность десятикратная. Деляночные опыты проводили на лугово- черноземовидной почве с содержанием легкогидролизуемого азота 5,1 мг на 100 г почвы. Размер учетной делянки 2 м2, по- вторность четырехкратная.

Результаты опытов приведены в табл.1.

Как видно из табл.1, прибавка урожая зеленой массы от инокуляции семян эспарцета штаммом 2921 составила 60,0 ц/га (15,4%) по сравнению с неинокулирован- ным вариантом. Штамм 820 оказался менее эффективным.

Пример 3. Те же штаммы испытывались в производственных условиях на эспарцете сорта Южноукраинский на черноземе южном суглинистом с содерхонием легкогидролизуемого азота 6.1 /100 г почвы. Размер учетной делянки 50 м2, повторность четырехкратная.

Результаты приведены в табл.2.

Как видно из табл.2, штамм 2921 более эффективен по сравнению со штаммом-прототипом 820 и в полевых условиях.

Предлагаемый штамм, кроме того, повышает содержание белка в зеленой массе эспарцета на 1,8%, что повышает его кормовую ценность, а также высокотехнологичен - набирает титр до 10 млрд клеток в 1 г ризоторфина.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Штамм бактерий Rhizobium sp.(Onobrychis) ВНИИСХМ Мг 2921 для производства удобрения под эспарцет.

Таблица 1

Использование: микробиологическая промышленность, производство средств повышения урожайности бобовых растений, в частности производство удобрения под эспарцет. Сущность изобретения. штамм бактерий Rhlzobium sp.fOnobrychis) выделен из клубеньков эспарцета. Депонирован в коллекции ВНИИСХМ под №2921. Штамм выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации и температуре 28-30°С в течение 36-48 ч. Получают культуральную жидкость с титром 4-5 млрд /мл, затем ино- кулируютторф, герметично запаянный в полиэтиленовые пакеты и подращивают культуру в течение 3-5 сут. при температуре 15-20°С. Получают ризоторфин с титром бактерий 5-10 млрд./г торфа. Полученный ризоторфин повышает урожай эспарцета на 8,6-26,6%. 2 табл. сл

Эффективность инокуляции семян эспарцета ризоторфином, изготовленным на основе

штаммов 820 и 2921

1784618

8 Таблица 2