Штамм бактерий ВRаDYRнIZовIUм LUpINI для получения бактериального препарата под люпин Советский патент 1990 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

СП

оэ ел оо оэ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм, предназначенный для изготовления бактериального удобрения нитрагина под люпин. Целью изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий, обладающего более высокой азотфиксирующей активностью и позволяющего получить более высокий по сравнению с известным урожай зеленой массы, зерна люпина и увеличить содержание белка в фитомассе люпина. Штамм BRADYRHIZOBIUM LUPINI 1622 выделен из клубеньков люпина желтого и депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИСХМ N 1622. Штамм BRADYRHIZOBIUM LUPINI 1622 при инокуляции семян люпина обеспечивает прибавку урожая зерна (по сравнению с известным штаммом) на 5 - 37%, зеленой массы - на 7 - 26%, содержание протеина в зерне - на 2,1 - 3,3%, в зеленой массе - на 1,1 - 1,4%. 3 табл.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм, предназначенный для изготовления бактериального удобрения нитрагина под люпин.

Целью изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий, обладающего более высокой азотфиксирую- щей активностью, позволяющего получить по сравнению с известным более высокий урожай зеленой массы, зерна люпина и

увеличить содержание белка в фитомас- се люпина.

Штамм Bradyrhizobium lupini К 1622 выделен из клубеньков люпина желтого

Lupinis luteus L.

При выделении штамма поступают следующим образом.

Отделенный от корней растений люпина клубенек отмывают водой, затем помещают на 1 мин в 95%-ный этиловый спирт, дезинфицируют в течение 3 мин ,

в 0,1%-ном растворе сулемы, отмывают от сулемы спиртом и затем стерильной водой. После промывки клубенек обожженным пинцетом переносят в стериль- ную пробирку, содержащую 3-5 капель воды, и раздавливают стерильной палочкой. Полученную бактериальную суспензию берут стерильной пипеткой и одну каплю наносят на разлитую в чаш- ки Петри агаризованную гаоляновую среду и тщательно растирают шпателем по всей поверхности, Затем этим ке шпателем последовательно обрабатывают поверхность агаризованной среды в

двух других чашках.

После Посева чашки ставят в термо- т при 28° С и через 7 дней на чашке с минимальным количеством колоний выбирают обособленную типичную, хоро- шо развитую колонию. Из колонии от

,бирают петлей культуру и Производят посев штрихом на скошенную агаризованную люпиновую среду, разлитую в пробирки. Одновременно одну петлю с культурой наносят в каплю стерильной

.воды на предметном стекле для микро- скопирования.

Пробирки с отвитой культурой помещают в термостат при 28°С, инкубируют в течение 10 дней и после хорошего развития бактерий хранят их в холодильнике при 4-5°С.

О чистоте изолята судят по резуль-

татам микроскопирования препаратов,

изготовленных из исходных колоний и отвитых на косяки в пробирки культур.

Штамм выращивают на люпиновом агаре, следующего состава: отвар люпина 1 л, КгЬР04 0,5 г, t gS04- 7H/J 0,2 г, NaCl 0,2 г5 CaSOq О,-I г, молибденовокислый аммоний - следы9 маннит (вносят после расплавления агара) 0%, агар-агар 20 г, РН 6,8-7,0.ф

Отвар люпина готовят следующим образом 50 г пророщенных высушенных семян желтого люпина заливают I л водопроводной воды, кипятят 30 мин, охлаждают, отфильтровывают через ватно- марлевый фильтр и доводят до первоначального объема.

Штамм Bradyrhizobium lupini идентифицирован по 8-у изданию Определи- теля микроорганизмов Берги. Депонирован во Всесоюзной коллекции клубень новых бактерий ВНИИСХМ под № 1622.

Штамм имеет следующие культураль- но-морфологические признаки.

s

0

5

0

,

S

5

У

5

Клетки одиночные, слегка т зогнутые палочки. Цепочки, споры отсутствуют. Размеры 7-суточной культуры клеток 0,8-1,0x1,4-1,9 мкм, Грамот- рицательные. Культура, медленно растущая.

Рост на плотных средах. Люпиновый агар, 28°С, 7 сут. Штрих обильньй, растекающийся, беловатый, слизистый. Колонии крупные 1,2-2 мм, белова-тые, слегка выпуклые с блестящей слизистой поверхностью и ровными краями.

Маннитно-дрожжевая агаризованная среда, 28 С 7 сут. Штрих идентичный, Колонии идентичные.

Среда Норриса агаризованная, 28 С, 7 сут. Штрих идентичный. Колонии идентичные.

Рост на жидких средах. Жидкая среда Норриса, 7 сут, 28°С, качалка 220 об/мин.

Характер роста. Равномерное помутнение среды с выпадением незначительного серовато-белого осадка в последние дни культивирования.рН в начале культивирования 6,3, после 7 сут выращивания 6,6.

Жидкая люпиновая среда, 28 С, 7 сут качалка 220 об/мин.

Характер роста идентичный, рН в начале культивирования 6,3, после 7 сут выращивания 6,5,,

Физиолого-биохимические свойства признаки.

На мясо-пептонном агаре штамм не растет. Молоко с лакмусом подщелачивает, слизистое кольцо на поверхности молока не образует. Желатину не разжижает. Аэроб. Растет при 20-30°С, Оптимум температуры +28 С. Оптимальное значение рН 6,2-6,5,

Растет на средах с углеводами. Хорошо использует сахарозу, глюкозу, лактозу, мальтозу; наилучший рост имеет на среде с маннитом, минимальный - с глицерином. Способен ассимилировать цитрат натрия.

Выход клеток на единицу использованного источника углеродного питания на 80% выше, чем у известного штамма - Khizobium lupini № ЗбЗа. Это свидетельствует об экономном расходовании штаммом источников углеродного питания.

Отношение к источникам азота. .

Хорошо использует азот глутамата натрия, слабее - азот аммонийных со лей нитратов, мочевины, пептона и

слабо усваивает дзот аспарагина. Восстанавливает нитраты в,нитриты.

В стимуляторах роста не нуждается.

Признаки штамма устойчивы. Штамм . не патогенен. Пересевается один раз в 6 мес и хранится при 4-5°С.

Используют штамм для получения бактериального удобрения следующим образом.

Жидкую люпиновую питательную среду приведенного состава разливают по 200 мл в конические стеклянные колбы емкостью 500 мл, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при атм (120°С) в течение 30 мин. После стерилизации в асептических условиях определяют рН среды и при отклонении рН от 6,2-6,3 приводят рН к указанному значению с помощью 10%- ных стерильных растворов НС1 или NaOH. Определяют сохранение стерильности среды. Для чего 1 мл среды с установленным рН в пределах 6,2-6,3 высевают глубинно на две параллельные стерильные чашки Петри и заливают мясо-пепто иным агаром с 0,5% глюкозы и 0,5% сахарозы. Чашки выдерживают в термостате при 28°С в течение 3-4 сут Отсутствие колоний микроорганизмов на МПА в чашках свидетельствует о стерильности среды. Питательную среду после проверки на стерильность засевают культурой штамма, который для этой цели выращивают до 10-15-дневного возраста на скощенной агаризован- ной люпиновой среде в пробирках.

Бактериальной суспензией из одной пробирки засевают одну колбу с 200 мл среды. Для этого в пробирку с культурой стерильной пипеткой добавляют 5 мл стерильной среды, осторожно снимают бактериальный слой, затем бактериальную суспензию пипеткой переносят в колбу с питательной средой. После этого культуру выращивают в колбах при 28 °С на качалке с 210 об/мин-в течение 5 сут. Полученный в результате культивирования продукт - суспензия клубеньковых бактерий люпина штамма If- 1622 содержит 1,5-3,0 млрд жизнеспособных клеток в 1 мл; ее используют в качестве инокулянта семян.

Пример 1. Использование бактериального препарата под люпин.

Микрополевые опыты по изучению эффективности штамма Bradyrhizobiutn lu- pini № 1622 проводят на почвах - дерново-подзолистой, супесчаной, площадь

0

делянок 50 м2, понторность 5-4-кратная. Посев проводят широкорядным способом. Применение удобрений, пестицидов: РёоК90 обработка посева симази- ном до появления всходов 1 кг/га и после появления всходов 1,0 кг/га,

Семена люпина накануне посева бактеризуют суспензией штамма следующим образом.

Для обработки семян берут такой . объем суспензии культуры, который после разбавтсния водой до 1,5 л имеет обции титр 400 млрд жичнеспо, со-бных клеток (266 млн/мл). Такой титр инокулюма соответствует титру клубеньковых бактерии в промышленных препаратах (ризоторфкн) для обработки одной гектарной нормы высеваемых

0 семян. Норма высева семян люпина в проведенных опытах 1,0-1,25 млн/га, количество наносимых на семя люпина клеток штамма 320-400 тыс.

Аналопгчным образом культивируют

5 и применяют в опытах известные культуры Rhizobium lupini Ј ЗбЗа и 373а. Учет урожая зеленой массы люпина проводят в фазу массового цветения сплошным методом. Качество урожая опQ ределяют по процентному содержанию протеина в зеленой массе растений.

Результаты определения симбиоти- ческой эффективности штамма Bradyrhi- zobium upini № 1622 в полевых опытах приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, штамм № 1622 характеризуется высокой эффективностью в проведенных 3-летних опытах. Штамм К: 1622 повышает урожай зерна в

Q среднем на 14% по сравнению с контролем (без бактеризации) и на 10% по сравнению с Rh. lupini № ЗбЗа (26,1 ц/га при урожае 22,8 ц/га в контроле и 23,7 ц/га - штамм № ЗбЗа);

5 содержание протеина в зерне увеличивает на 2,-8% по сравнению с известным штаммом ЗбЗа.

Пример 2. Влияние предпо- севкой бактеризации семян люпина штам0 MOM N3 1622 на урожай и его качество изучают в производственных опытах на почвах - зерново-подзолистых, супесчаных. Вносят удобрения из расчета выноса урожаем РК. Бактеризацию семян

5 проводят методом, описанным в примере 1 .

Результаты применения Bradyrhozobi- um lupini N 1622 представлены в табл. 2 и 3.

1156583

Приведенные данные показывают, что прибавка урожая зеленой массы составляет в среднем 18% (562 ц/га при урожае от использования известного штамма 482 ц/га) и урожая семян - на 20%. Бактеризация семян люпина штаммом К 1622 увеличивает содержание протеина в зеленой массе и зерне на 31% по

Контроль - без бакте- риз ации

Rh. lupini № ЗбЗа Bradyrhizobium lupini № 1622

НСР

Oi95

, ц/га

Р, %

Контроль - без бакте- риз ации

Rh. lupini N9 ЗбЗа Bradyrhizobium lupini № 1622

НСР

0,95

, ц/га

Р, %

.

Контроль - без бактеризации

Rhi lupini № ЗбЗа Bradyrhizobium lupini № 162-2

НСР0(95, ц/га Р, %

Контроль - без бакте- риз ации

Rh. lupini. № ЗбЗа

Bradyrhizobium lupini № 1622

8

сравнению с известным штаммом bium lupini № ЗбЗа.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bradyrhizobiuro lupini ВНИИСХМ № 1622 для получения бактериального препарата под люпин.

Таблица

38,3

689

1Контроль - без бактеризации

Eh. lupini № ЗбЗа Bradyrhizobiura lupini № 1622

2Контроль - без бактеризации

Rh. lupini IF ЗбЗа Bradyrhizobuira lupini IP 1622

3Контроль - без бактеризации

Rh. lupini № ЗбЗа Bradyrhizobium lupini № 1622

дние Контроль - без бактери- ные з ации

всем „, . . . .„ -,0

Rh. lupini № ЗбЗа там

Bradyrhizobiura bupi- ,.ni If 1622

Таблица 2

Таблица 3

37,3 474 354

37,9

470 386

40,4 556 505 36,9 - 144

36,8

39,6 39,0

41,4

500

154

206

273

531 373

1 9 17 43

7 43

6 37

37,7 489 256

38,7 501 502

18

41,6 652 383 33 49