СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2001 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к лабораторным способам идентификации микроорганизмов, и может быть использовано для идентификации микобактерий.

Известен способ видовой идентификации микобактерий, согласно которому выделенные при первичном выращивании культуры микобактерий туберкулеза засевают на пробирки с дифференциально-диагностическими средами, в том числе содержащими глицерин и индикатор - бромкрезоловый пурпурный для среды Вагенера и Мичерлиха и бромтимолового синего для среды Лебека. Дифференцию наблюдают после трех недель инкубирования при 37^oC на столбиках среды по изменению исходного цвета среды на желтый. Эффективность дифференции микобактерий составила 94,8-100% для М. tuberculosis и 80-99,2% для М. bovis.

Г. К. КОВАЛЕВ. Сравнительная характеристика некоторых питательных сред, используемых для дифференциации М. bovis и М. tuberculosis, Лабораторное дело, 1988, N 4, с. 11-14.

Однако дифференциация полученных культур микобактерий возможна лишь для двух видов микобактерий, что недостаточно информативно.

Технический результат, достигаемый от реализации изобретения, - унификация и повышение специфичности способа.

Сущность изобретения заключается в том, что для определения микобактерий в свежевыделенных штаммах используют растворы базофильных анилиновых красок - нейтральрот, метиленовый голубой, малахитовый зеленый на основе 5% мясопептонного глицеринового бульона, в концентрации 0,01 мг/мл, с внесенными парафиновыми дисками и суспензией микобактерий исследуемого штамма в концентрации 2 млрд микробных клеток/мл с последующей регистрацией сроков изменения исходного цвета среды у отдельных видов микобактерий.

Для М. tuberculosis характерно обесцвечивание раствора нейтральрот (HP) за 48-72 ч, метиленового голубого (МГ) за 12-17 ч, малахитового зеленого (МЗ) за 78-92 ч; для М. bovis - HP - 38-48 ч, МГ - 16-18 ч, МЗ - 82-93 ч; для М. avium и атипичных микобактерий - HP - 9-14 ч, МГ - 10-13 ч, МЗ - 19-24 ч.

Пример 1. Определение специфичности способа.

В опыте использовали микобактериальные штаммы, полученные из музея Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: М. tuberculosis Н₃₇ Rv, М. bovis-12, М. avium-780, М. scrofulaceum, М. smegmatis. В качестве питательной среды использовали растворы базофильных анилиновых красок (нейтральрот, метиленовый голубой, малахитовый зеленый) в концентрации 0,01%, для чего к навескам порошка (0,02 г) каждой краски добавляли по 200 мл стерильного 5% МПГБ (впрок приготовленного по общепринятой прописи с pH 7,0). Смесь краски с бульоном стерилизовали кипячением в течение 10-15 мин на водяной бане, фильтровали и использовали. Растворы анилиновых красок готовили в день использования.

Музейные штаммы выращивали на селективной среде Левенштейна-Йенсена в течение 4 -19 сут. Чистоту культуры проверяли визуально и изучением мазков, окрашенных по Циль-Нильсену. Из полученной бактериальной массы готовили суспензии каждого из штаммов на стерильном физиологическом растворе, в концентрации 10 млрд. микробных клеток/мл по оптическому бактериальному стандарту БЦЖ.

Полученные растворы анилиновых красок разливали по 10 мл в колбы (емк 50 мл), по 3 колбы с различными красками (нейтральрот, метиленовый голубой, малахитовый зеленый) для каждого исследуемого штамма и помещали парафиновые диски на поверхность питательной среды в каждой колбе. Затем вносили суспензию каждого вида микобактерий в отдельности (по 2 мл) в 3 колбы с различными растворами красок, чтобы концентрация микробных клеток в питательной среде составляла 2 млрд/мл. Колбы закупоривали ватно-марлевыми пробками. В качестве контроля использовали растворы каждой анилиновой краски с парафиновыми дисками, но без суспензий микобактерий.

Посевы и контроль инкубировали в термостате при 37,5^oC. Учет результатов проводили по срокам полного обесцвечивания питательной среды с красками, путем визуального осмотра посевов.

Сроки обесцвечивания растворов анилиновых красок составили: для штамма М. tuberculosis Н₃₇ Rv - нейтральрот (HP) - 56 ч, метиленового голубого (МГ) - 14 ч, малахитового зеленого (МЗ) - 82 ч; для M.bovis-12-HP - 43 ч, МГ-17 ч, МЗ - 87 ч; для M. avium-780 - HP - 11 ч, МГ - 12 ч, МЗ - 21 ч; для M. scrofulaceum-HP - 11 ч, МГ - 13 ч, МЗ - 23 ч; для М. smegmatis - HP - 10 ч, МГ - 12 ч, МЗ - 20 ч.

Пример 2. Сравнительное изучение специфичности способа идентификации в зависимости от способа выделения культуры.

Исследовали патологический материал от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, павших кур, больных туберкулезом людей, а также пробы с объектов внешней среды.

93 штамма микобактерий выделили путем культивирования на парафиновых дисках в жидких питательных средах. На 2-7 сутки после внесения исследуемого материала, при появлении характерного роста микобактерий бактериальную массу снимали с парафиновых дисков, готовили суспензии и идентифицировали по срокам обесцвечивания анилиновых красок, как указано в примере 1.

74 штамма микобактерий выращивали на плотных элективных средах в течение 3 - 25 суток с последующей идентификацией согласно изобретению.

Параллельно те же штаммы идентифицировали с применением культурально-биохимических методов (морфология клеток, микро- и макроколоний на жидких и плотных питательных средах; наличие и скорость роста при 22, 37 и 45^oC; образование пигмента в культурах на жидких и плотных питательных средах: наличие роста на среде с салицилатом натрия; наличие ниацина; наличие ферментов - уреазы, никотинамидазы, пиразинамидазы, арилсульфатазы; редукция нитратов). В некоторых случаях результаты идентификации подтверждались тестированием штаммов методом ПЦР.

Результаты исследований представлены в таблицах.

Из таблицы 1 видно совпадение результатов идентификации выделенных штаммов различными способами исследований, независимо от способа выделения культуры, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением.

Диапазоны сроков обесцвечивания растворов анилиновых красок отдельными видами и группами микобактерий, указанные в таблице 2, отражают некоторое различие биологических свойств штаммов микобактерий, обусловленное влиянием факторов внешней среды, и являются максимально возможными.

Предложенный способ обладает значительной разрешающей способностью и позволяет эффективно, в кратчайшие сроки, с наименьшими затратами средств и труда провести идентификацию микобактерий, что создает основу для своевременного и успешного проведения комплекса противотуберкулезных мероприятий.

Использование предложенного способа идентификации микобактерий в сочетании с выделением культур микобактерий методом культивирования на парафиновых дисках в жидких питательных средах позволяет значительно сократить сроки проведения диагностических исследований.

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к лабораторным способам идентификации микроорганизмов, и может быть использовано для идентификации микобактерий. Суспензию микроорганизмов засевают на парафиновые диски, помещенные на жидкую питательную среду с раствором базофильных анилиновых красителей - нейтральрот, метиленовый голубой и малахитовый зеленый. По срокам изменения исходного цвета среды (обесцвечивания) на желтый идентифицируют виды микобактерий. Для M. tuberculosis характерно обесцвечивание раствора нейтральрот (НР) за 48-72 ч, метиленового голубого (МГ) за 12-17 ч, малахитового зеленого (М3) за 78-92 ч; для M. bovis - НР - 38-48 ч, МГ - 16-18 ч, МЗ - 82-93 ч; для М. avium и атипичных микобактерий - НР - 9-14 ч, МГ - 10-13 ч, МЗ - 19-24 ч. Предложенный способ обладает значительной разрешающей способностью и позволяет эффективно, в кратчайшие сроки, с наименьшими затратами средств и труда провести идентификацию микобактерий, что создает основу для своевременного и успешного проведения комплекса противотуберкулезных мероприятий. 2 табл.

Способ идентификации микобактерий, предусматривающий посев исследуемой суспензии микроорганизмов на жидкую питательную среду с глицерином и красителем, инкубацию и идентификацию по срокам изменения исходного цвета среды на желтый, отличающийся тем, что суспензию микроорганизмов в концентрации 2 млрд микробных клеток /мл засевают на парафиновые диски, помещенные на жидкую питательную среду, используя в качестве красителя растворы базофильных анилиновых красок - нейтральрот, метиленовый голубой и малахитовый зеленый в концентрации 0,01 мг/мл, при этом сроки изменения исходного цвета среды составляют: для микобактерий М. tuberculosis - нейтральрот (НР)-48-72 ч., метиленовый голубой (МГ)-12-17 ч, малахитовый зеленый (МЗ)-78-92 ч, микобактерий М. bovis - НР-38-48 ч, МГ-16-18 ч, МЗ-82-93 ч, микобактерий - М. avium и атипичные микобактерии - НР-9-14 ч, МГ-10-13 ч и МЗ-19-24 ч.