СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ М. TUBERCULOSIS И М. BOVIS Российский патент 1995 года по МПК G01N33/49 G01N29/02 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к лабораторным способам идентификации микроорганизмов, и может быть использовано для идентификации микобактерий туберкулеза.

Видовая идентификация штаммов микобактерий туберкулеза необходима для установления источника заболевания, что имеет значение при выборе противотуберкулезных мероприятий в очаге инфекций.

Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза по культуральным, бактериологическим и биологическим свойствам выделенных штаммов. Однако этот способ продолжителен во времени, недостаточно информативен из-за изменения культуральных, бактериологических и биологических свойств под влиянием различных факторов внешней среды и трудоемок.

Известен также способ определения микобактерий M. bovis, M. tuberculosis путем определения в газохроматографическом спектре жирных кислот, выросших на твердых питательных средах после селективной обработки патологического материала или образцов окружающей среды, соотношения гексакозановой (С₂₆:0) и тетракозановой (С₂₄:0) кислот. Однако клетки M. tuberculosis и M. bovis, выросшие на плотной яичной среде, имеют сходные профили жирных кислот. Видовая идентификация возможна на основе определения соотношения длиноцепочечных кислот, что требует затрат времени и труда.

Цель изобретения повышение специфичности и упрощение способа.

Это достигается тем, что для определения микобактерий туберкулеза в биологической пробе путем посева биологической пробы на твердую питательную среду, инкубации с последующим проведением газохроматографического анализа культуры клеток и регистрацией маркерного вещества, используют среду следующего состава: KH₂PO₄ 0,9700-1,0300 г Na₂HPO₄ 2,4250-2,5750 г MgSO₄ 0,0485-0,0515 г (NH₄)₂SO₄ 0,4850-0,5150 г
Лимоннокислый натрий 0,0970-0,1030 г Пируват натрия 0,4850-0,5150 г
Лимоннокислое железо 0,0390-0,0410 г CuSO₄ 0,001 г Малахитовый зеленый 0,001 г Агар Дифко (ПА) 14,5500-15,4500 г Глицерин 1,94-2,06 мл Дистиллированная вода До 1000 мл, в качестве маркерного вещества пентикозановую кислоту, при ее отсутствии определяют наличие микобактерий M. bovis, а при ее присутствии наличие микобактерий M. tuberculosis.

П р и м е р 1. Определяют специфичности питательной среды. Используют среду следующего состава: KH₂PO₄ 0,9700 г Na₂HPO₄ 2,4250 г NgSO₄ 0,0485 г (NH₄)₂SO₄ 0,4850 г Лимоннокислый натрий 0,0970 г Пируват натрия 0,4850 г Лимоннокислое железо 0,0390 г CuSO₄ 0,001 г Малахитовый зеленый 0,001 г Глицерин 1,94 мл Агар Дифко (ПА) 14,5500 г Дистиллированная вода До 1000 мл
Среду стерилизуют кипячением в течение 30 мин на водяной бане, горячей разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Патологический материал засевают на селективную среду Левенштейна-Йенсена, визуально проверяют чистоту культуры и делают мазки с окраской по Цилю-Нильсену. Культуры со среды Левенштейна-Йенсена пересевают на среду в соответствии с изобретением. Штаммы выращивают в течение 2-3 недель при 37^оС. Снятую с питательной среды бактериальную массу в количестве 2-5 мг помещают в ампулу, добавляют несколько капель (0,1-0,2 мл) 7% -ного раствора ГТМА в 80%-ном водном метаноле. Запаянные ампулы прогревают при 120-130^оС в течение 15-20 мин, в результате проба приобретает вид прозрачного или опалесцирующего раствора.

2-3 мкл анализируемого материала вводят микрошприцом в испаритель газового хроматографа.

Газохроматографический анализ проводят на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Используют две стальные колонки длиной 1,5-2,0 м и диаметром 3 мм. Колонки заполняют целитом-545 (60-80 меш) с нанесенной на него жидкой фазой 7% апиезона 1. Приготовление сорбента и заполнение колонок проводят общепринятыми методами.

Основные рабочие параметры: температура термостата колонок в режиме программирования от 180 до 280^оС при скорости нагрева 8^оС в 1 мин; температура испарителя 370^оС; расход газа-носителя и водорода 2,4 л/ч, воздуха 25 л/ч.

На хроматограммах микобактерий выявляются жирные кислоты с алифатической цепью, содержащей нечетное число атомов углерода. Основным отличительным признаком является наличие пентакозановой кислоты (С₂₅:0). У микобактерий M. bovis пентакозановая кислота отсутствует, а у микобактерий M. tuberculosis присутствует.

П р и м е р 2. Проводят сравнительное изучение специфичности способа видовой идентификации в зависимости от состава среды.

45 штаммов микобактерий туберкулеза выращивают на картофельно-глицериновой среде Павловского с последующим проведением газохроматографического анализа, как в примере 1. Параллельно исследуют те же штаммы. В опыт берут штаммы из коллекции ГИСК им. Тарасевича и свежевыделенные от больных туберкулезом людей и крупного рогатого скота.

Свежевыделенные штаммы идентифицируют с применением культурально-биохимических методов (морфология клеток и колоний, скорость роста при 37^оС, наличие роста при 22 и 45^оС, наличие роста в среде с салицилатом натрия и с 5% NaCl, наличие ферментов: галактозидазы, уреазы, никотинамидазы, пиразинамидазы, гидролиза Твин-80, арилсульфатазы; редукция нитратов, наличие ниацина. Несколько штаммов идентифицированы до вида с помощью биопробы на кроликах.

Результаты представлены в таблице.

Из таблицы видно полное совпадение результатов биохимических, биологических и газохроматографических исследований, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением.

П р и м е р 3. Проводят видовую идентификацию 53 штаммов микобактерий туберкулеза, отобранных из 120 штаммов микобактерий, выделенных на плотных яичных средах из патологического материала от больных людей и животных по результатам газохроматографического анализа жирных кислот известным способом. 53 штамма исследуют, как в примере 1.

Результаты идентификации: в спектре жирных кислот 29 штаммов микобактерий туберкулеза отсутствует пентакозановая кислота, их относят к M. bovis, в спектре жирных кислот 24 штаммов микобактерий туберкулеза присутствует пентакозановая кислота, их относят к M. tuberculosis.

Биохимические исследования чистой культуры подтвердили результаты видовой идентификации способом в соответствии с изобретением.

Проведенные исследования показали, что предложенный способ в соответствии с изобретением отвечает современным требованиям, обладает значительной разрешающей способностью при относительной простоте его осуществления.

Использование: ветеринария, медицина. Сущность изобретения: для определения микобактерий туберкулеза в биологической пробе путем посева биологической пробы на твердую питательную среду, инкубации с последующим проведением газохроматографического анализа культуры клеток и регистрацией маркерного вещества используют среду следующего состава, г: KH₂PO₄ 0,9700 1,0300, Na₂HPO₄ 2,4250 2,5750, MgSO₄ 0,0485 - 0,0515, (NH₄)₂SO₄ 0,4850 0,5150, лимоннокислый натрий 0,0970 0,1030, пируват натрия 0,4850 0,5150, лимоннокислое железо 0,0390 0,0410, CuSO₄ 0,001, малахитовый зеленый 0,001, глицерин 1,94 2,06 мл, агар Дифко 14,5500 15,4500, дистиллированная вода до 1000 мл, а в качестве маркерного вещества пентоказановую кислоту C₂₅:O. 1 табл.

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ М TUBERCULOSIS И М BOVIS, включающий посев биологической пробы на твердую питательную среду на основе глицерина, инкубацию посевов с последующим проведением газохроматографического анализа полученной биомассы и идентификацией бактерий по жирным кислотам, отличающийся тем, что посев проводят на питательную среду следующего состава, г/л
KH₂PO₄ 0,9700 1,0300
Na₂HPO₄ 2,4250 2,5750
Mg S O₄ 0,0485 0,0515
(NH₄)₂SO₄ 0,4850 0,5150
Лимоннокислый натрий 0,0970 0,1030
Пируват натрия 0,4850 0,5150
Лимоннокислое железо 0,0390 0,0410
CuSO₄ 0,001
Малахитовый зеленый 0,001
Агар Дифко (ПА) 14,5500 15,4500
Глицерин 1,94 2,06
Дистиллированная вода До 1,0
из жирных кислот выделяют пентакозановую кислоту и при ее наличии идентифицируют микобактерии M. tuberculosis, а при ее отсутствии - микобактерии M.bovis.