СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 

Данное изобретение относится к области медицины, разделу “бактериология”, а именно к лабораторным методам диагностики туберкулеза.

Известные в практических лабораториях методы определения чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам длительны и предполагают (с учетом выхода культур) срок 49-60 дней. Методы определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам с применением современных технологий используются в силу своей дороговизны далеко не во всех лабораториях. Кроме того, в арсенале фтизиобактериологов имеется метод прямого определения лекарственной чувствительности. Этот метод предполагает наличие микобактерий в исследуемом материале, подтвержденный методом прямой бактериоскопии. Но и он не всегда позволяет получить положительный результат.

Таким образом, поиск достаточно быстрого, с гарантированным результатом данных лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам в условиях практических лабораторий сохраняет свою актуальность и имеет предпосылки для его усовершенствования.

Прямым способом определение лекарственной чувствительности осуществляется как на жидких, так и на плотных питательных средах (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе М., Медицина. - 1973. - С.60-71.)

1. Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам на жидких питательных средах.

Из мокроты приготавливают и обрабатывают мазки. Количество мазков определяется количеством противотуберкулезных препаратов и тех концентраций, к которым предполагается изучить устойчивость микобактерий. Обработанные мазки опускают стерильным пинцетом в бактериологические пробирки, в которые предварительно разлиты среды с различным содержанием противотуберкулезных препаратов и контрольную со средой без препарата. Через 10-14 дней пробирки со стеклами стерилизуют. После стерилизации мазки вынимают из пробирок, высушивают, фиксируют над пламенем, окрашивают по Циль-Нильсену и микроскопируют (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. М., Медицина. - 1973. - С.60-71.)

2. Определение лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам на плотных питательных средах.

Диагностический материал (мокрота), при наличии бактериоскопическим методом по Циль-Нильсену 1-5 палочек микобактерий, обрабатывают также как для обычного посева.

Обработка материала с использованием для посева осадка (Т.Н.Ященко, И.С.Мечева Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе М., Медицина. - 1973. - С.37). Для обработки берут равное по отношению к материалу количество 10% раствора трехзамещенного фосфорно-кислого натрия, хорошо перемешивают и помещают в термостат на 20-24 часа, после чего смесь центрифугируют и осадок засевают на 3-4 пробирки яичной среды.

При прямом методе определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза на плотных средах патологический материал обрабатывают вышеуказанным способом и засевают на плотные питательные среды, содержащие различные концентрации противотуберкулезных препаратов. Чтение результатов определения чувствительности через 21 день инкубации (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. М., Медицина. - 1973. - С.70-71.)

Первичное культивирование микобактерий туберкулеза из диагностического материала затруднено тем, что при посеве бактериоскопически положительного диагностического материала не всегда удается получить результат, т.е. данный прототип недостаточно информативен. И как следствие клиницисты получают отрицательный результат прямого определения и вынуждены ждать выхода культуры для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза непрямым методом, т.е. сроки получения результатов удлиняются.

С целью повышения информативности исследования предложен способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза путем посева люминесцентно-положительного диагностического материала на плотную питательную среду отличающийся тем, что перед посевом на плотную яичную среду, с антибактериальными препаратами осадка с диагностического материала последний заливают жидкой средой Школьниковой. После подращивания микобактерий туберкулеза в течение 3-х суток производится замена надосадочной жидкости на свежую среду Школьниковой в количестве 3 мл.

Материал (мокрота) подвергается первичной обработке с целью подавления сопутствующей микрофлоры, что предупреждает загрязнение посевов. Обработка проводится по Балану В.Ф. хлоргексидинбиглюконикумом.

Диагностический материал заливается равным объемом (1:1) 0,05% раствора хлоргексидинбиглюконикумом. Тщательно гомогенизируют. Оставляют на 10-12 часов при комнатной температуре. На следующий день материал центрифугируют при 1500-2000 об\мин в течение 10 мин. Сливают надосадочную жидкость, оставив осадок. Последний заливают 2,0 мл жидкой среды Школьниковой. Инкубируют в термостате при Т 37°С в течение 3 суток. По истечении этого срока, надосадочную часть среды Школьниковой сливают, не центрифугируя. Заливают 3,0 мл свежей среды Школьниковой. Осадок перемешивают и засевают по 0,2 мл на плотные яичные среды с содержанием противотуберкулезных препаратов. Срок выдачи результатов через 3 недели (21 день).

Пропись полусинтетической среды Школьниковой (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе М., Медицина. - 1973. - С.153):

Калия одноосновного фосфорно-кислого - 1,5 г

Натрия двуосновного фосфорно-кислого - 2,5 г

Магнезии серно-кислой - 05 г

Натрия лимонно-кислого (среднего) - 1,5 г

Железа лимонно-кислогоаммиачного - 0,005 г

Л-аспарагина - 1 г

Воды дистиллированной 1 л

Таблица 1Сравнение сроков выхода и интенсивности роста культур микобактерий туберкулеза пересеянных с жидкой среды Школьниковой на яичные средыСроки пересева с жидкой среды на плотнуюСроки выхода культур на яичной среде (дни, сред. арифм.)Интенсивность роста на яичной средеЧерез 3 дня15,5+++Через 5 дней15,5++Через 7 дней17,5+(Интенсивность роста МВТ оценивалась в крестах: ++ до 20 колоний; +++ больше 20 колоний)

При наличии роста микобактерий только в контрольных пробирках штамм считается чувствительным. При наличии роста более 20 колоний микобактерий в пробирках с той или иной концентрацией препарата культура расценивается, как устойчивая.

Таблица 2Сравнение сроков выхода и интенсивности роста культур микобактерий туберкулеза без замены и с заменой на свежую жидкую среду при пересеве на яичные среды Сроки выхода культур на яичной среде (дни, сред. арифм.)Интенсивность роста на яичной средеБез замены на свежую жидкую среду Школьниковой15,5+С заменой на свежую жидкую среду Школьниковой12,5+++

Доказано, что наиболее оптимальный срок инкубирования осадка с нативного материала является 3-х дневный. В табл. 1 приводятся сравнительные данные по срокам выхода культур микобактерий туберкулеза и интенсивности роста микобактерий в зависимости от сроков пересева осадка диагностического материала с жидкой среды на яичную. Из приведенных данных следует, что наиболее оптимальный срок пересева с жидкой среды на яичную через 3 и 5 дней роста. Но при сроке “через 3 дня” на яичной среде отмечается более интенсивный рост культур микобактерий.

Таблица 3Рост микобактерий туберкулеза при определении лекарственной чувствительности предложенным и сравниваемым методамиГруппы БольныхРост микобактерий туберкулеза А.ч., %Роста микобактерий туберкулеза нет А.ч., %Контрольная186N=2475,0%25,0%Опытная22-N=25100,0% 

После 3-х дневной инкубации осадка обязательным является замена среды Школьниковой на свежую среду. Проведенными экспериментами доказано, что если произвести пересев осадка диагностического материала без замены жидкой среды на свежую сроки выхода культур микобактерий удлиняются до 15,5 дней и интенсивность роста на яичной среде оценивается до 1 креста. Если среда в которой производили инкубирование в течение 3-х дней сливается и заменяется на свежую, то отмечается укорочение сроков выхода культур в среднем до 12,5 дней и что самое важное интенсивность роста микобактерий оценивается в 3 креста, что является основным при оценке роста микобактерий на яичной среде при определении лекарственной чувствительности (табл.2). Данная манипуляция способствует удалению токсических продуктов метаболизма микобактерий, образовавшихся во время лаг-фазы размножения микроба.

Предложенный способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам испытана на 49 больных различными формами туберкулеза, с установленным люминесцентно-положительным мазком мокроты (24 - контрольная группа, 25 - опытная). В контрольной группе больных лекарственная чувствительность определялась на плотных средах, в опытной предложенным методом. Результаты исследований приведены в таблице 3.

У больных с люминесцентно-положительным мазком мокроты использование предлагаемого способа определения лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам с предварительным подращиванием микобактерий в жидкой питательной среде позволило получить результат в 100% случаев. Предлагаемый нами способ определения лекарственной чувствительности прост в выполнении, доступен для любой микробиологической лаборатории.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для определения лекарственной чувствителности микобактерий туберкулеза. Сущность способа состоит в том, что диагностический материал предварительно заливают раствором хлоргексидинбиглюконикума, гомогенизируют, оставляют на 10-12 часов при комнатной температуре, центрифугируют, осадок заливают жидкой средой Школьниковой, инкубируют при 37°С в течение 3 суток, сливают надосадочную часть среды Школьниковой, заливают свежей средой Школьниковой, осадок перемешивают, засевают на плотные яичные среды и чувствительность штамма определяют через 3 недели по наличию роста только в контрольной пробирке. Техническим результатом является повышение точности способа и сокращение сроков определения.

Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза путем посева диагностического материала на плотную яичную питательную среду с антибактериальными препаратами, отличающийся тем, что предварительно диагностический материал заливают равным объемом 0,05%-ного раствора хлоргексидинбиглюконикума, гомогенизируют, оставляют на 10-12 ч при комнатной температуре, центрифугируют 10 мин при 1500-2000 об/мин, осадок заливают 2,0 мл жидкой среды Школьниковой, инкубируют при 37°С в течение 3 суток, сливают надосадочную часть среды Школьниковой, заливают 3,0 мл свежей среды Школьниковой, осадок перемешивают, засевают по 0,2 мл на плотные яичные среды и чувствительность штамма определяют через 3 недели по наличию роста только в контрольной пробирке.