Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности производству антибиотиков.
Для осуществления способа используют штамм Streptomyces averraitilis NCI Б 12121, который характеризуется следующими свойствами.
Кулътурально-морфологические признаки.
Спиральные цепи спор на среде 1SP4.
Серая пигментация воздушного мицелия на среде JSP 4.
Отсутствие четкой пигментации субстрата мицелия на среде 1SP 4. Отсутствие способного диффундировать пигмента на среде ISP 5.
Образование меланина на 1 SP 6; пептон-дрожжи-желе зный агар. Биохимические свойства.
Ферментивная активность:
ы
Восстановление нитратаОбразование
Гидролиз гиппурата Продукты деградации: Гуанин
Мочевина+
Аллантоиин+
Температура выращивания: 45°С
Рост в присутствии: 7%-ного хлористого натрия + О,1%-ного фенола+
О,0001%-ного теллурита калия+
Рост на единичном источнике азот (0,1 мас./об.%))
L-Цистеин+
L-Валин+
L-Фенилаланин+
L-Гистидин+
L-ГидроксипролинНитрат калия
Рост на единичном источнике углерода (1 мас./об.%):
L-Арабиноза+
Сахароза+
D-Ксилоза+
мезо-Инозит+
Маннит+
D-Фруктоза+
L-Рамноза+
Раффиноза+
D-Лактоэа
СалицинD-Мелибиоза+
Ацетат натрия
(0,1 мас./об.%)+
Пропиннатнатрия
(0,1 мас.Уоб.%)«
Пируват натрия (0,1 мас./об.%)+
(ISP - среды согласно международном проекту по стрептомицину (ISP)).
Пример 1. Получение 25-цик лопентил-авермектин А2.
Суспензию культуры на скошенном агаре S.avermitilis NCI В 12121 инок лируют в 600 мл среды, содержащей лактозу (12,0 г), барду (8,0 г) и дрожжевой экстракт (3,0 г), в трехлитровой колбе, и инкубируют при 28 в течение 3 дней. Этот инокулюм используют для инокулирования 16 л срды, содержащей растворимый крахмал (640 г), гульйат аммония (32 г), втричный кислый Фосфат калия (16 г), хлористый натрий (16 г), сулыЬат мания 7НгО (16 г), карбонат кальция
0
5
0
5
0
5
0
(32 г), растворимый дрожжевой экстракт (6,4 г), сульбат железа (II) х 7Ht 0 (0,016 г), сульфат пинка 7 Н20 (0,016 г) и хлорид марганца СО,01 6 г), в двадцатилитровом сЬермен- тере. Ферментируемую массу инкубируют при 28°С при перемешивании со скоростью 250 об. мин и подают воздух со скоростью 15 л/мин. Натриевую соль цик- лопентакарбоновой кислоты (1,6 г) добавляют через 24 ч, и снова через 28 и 72 ч инкубирования, а Ферментацию продолжают 120 ч. После этого времени мицелий удаляют фильтрованием и экстрагируют смесью ацетон: 1н. соляная кислота (100:1, л). Полученный экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном давлении и экстрагируют метиленхлоридом ( л). Метиленхлоридный экстракт концентрируют досуха до получения неочищенного продукта в виде подвижного масла, которое растворяют в диэтиловом эсЬире и вводят в колонку С силикагелем (1 кг). Колонку элюируют диэтиловым эфиром, собирая сЬракции по 100 мл. Фракции 20-40 объединяют, и растворитель выпаривают, получая практически очищенный материал. Продукт растворяют в смеси метанола и воды (4:1) и хроматограбшруют на CIS Micro-Bqnda- pack колонке (50 см) в высокоэффективном жидкостном хроматографе, используя тот же растворитель со скоростью потока 100 мл/мин. Фракции 35- 50, содержащие целевой продукт, объединяют и повторно хроматографируют на С18 Zorbax ODS колонке (21 мм 15 см), элюируя смесью метанола и воды (4:1) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие Лракиии объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формул
В
50
(1)
где R1 - ОН, двойной свячи нот; R4 - циклопентил; RS CF3; 4 4-(апъЛаZ-оле анд рос ил ) -альфа -Z -о л е анд ро с илок - си,
СН3 х (2)
LO но - - о -Ч Ь
снэо снз°
в виде белого порошка с т.пл. 150,5- 151°С. Строение продукта подтвержден но данным масс-спектрсметрии и ЯМР
С.
Mace-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами проведена на масс-спектрометре VG модель 7070Е с использованием матрицы образца три- этиленгликоля с твердым хлористьм натрием, (M+Na)4 наблюдается при й/е 939 (теоретически 939). Масс-спект- рометрий электронного удара проводят на масс-спектрометре VG Модель 707OF, Значение т/е для основных Фрагментов следующие: 335, 3J7, 275, 25J, 205, 181, J79, J45, 127, 413, 1Л, 96 и 87
Данные ЯМР С получены на спектрометре Брукер Модель Т1-250 для образца концентрации 20 мг/м в дейтеро- хлороформе. Химические сдвиги в м.д. по отношению к тетраметилсилану: 14,1; 15,3; 17,8; 18,5; 19,9; 20,3; 24,6$ 25,9; 26,2; 29,3; 34,4 (2С), 34,7, 36,7; 37,8; 39,8; 40,5; 41,0; 41,3; 45,8; 56,4; 56,6; 57,8; 67,4; 68,0;68,7; 69,9; 70,5; 76,0; 77,6 (2С), 78,3; 79,5; 80,7 (2С); 81,8; 94,9;98,7; 99,8; 117,7; 118,5; 119,8; 125,0; 135,8; 136,3; 137,8; 160,1 173,8.
Пример 2. Суспензию культуры на скошенном агаре S.avermitilis АТСС 31271 инокулируют в 50 мл среды, содержащей лактозу (1,0 г), барду (0,75 г) и дрожжевой экстракт (0,25 г), в колбе объемом 350 мл и инкубируют при 28 С в течение 3 дней. Этот инокулюм (4 мл) испольэ- ют для инкубирования каждой из 50 колб, содержащих кукурузный крахмал (2,0 г), соевую муку (0,35 г) и дрожжевой экстракт (0,25 г), объемом 350 мл, которые инкубируют при 28 С.
Через 24 ч в каждую колбу добавляют натриевую соль циклопентакарбоно- вой кислоты (5 мг) и инкубирование продолжают в течение следующих 5 дней После этого содержимое колб извлекают и мицелий выделяют центрифугирова
0
5
0
0
5
с
нием. Полученный мицелий экстрагирует смесью ацетон:1н. соляная кислота (100:1), и ацетоновый экстракт концентрируют досуха. Экстракт анализируют с помощью высокоэффективно жидкостной хроматографии и показывают, что он содержит продукт, идентичный продукту примера 1.
Пример 3. Получают инокулюм по примеру 1 и используют его для инокулирования 50 мл среды как в примере 1, заключенной в колбу емкостью 350 мл. После инкубирования в течение 24 „ч добавляют 2-амино-циклопеитил- уксусную кислоту (циклопентилглииин) (5 мг) и ферментацию продолжают еще 5 дней. Полученный продукт выделяют, экстрагируя мицелий ацетоном и мети- ленхлоридом. Экстракт анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, данные которой указывают на то, что продукт содержит соединение, идентичное продукту примера 1 .
Пример 4. Воспроизводят условия примера 3, за исключением того, что в качестве субстрата используют циклопентилметанол с аналогичными результатами.
Пример 5. Воспроизводят условия примера 3, за исключением того, что в качестве субстрата используют сложный метиловый эфир циклопентакар- боновой кислоты с аналогичными результатами.
Пример 6. Воспроизводят условия примера 3, за исключением того, что в качестве субстрата используют циклопентанкарбоновую кислоту, растворенную в метаноле, с аналогичными результатами.
Пример 7. Получение 25-(ти- ен-3-ил)-авермек тин.
Суспензию культуры на скошенном агаре S.avermitilis NCIB 12121 инокулируют в 600 мл среды, содержащей лактозу (12,0 г), барду (8,0 г) и дрожжевой экстракт (3S0 г), в трех- Q литровой колбе и инкубируют при 28°С в течение 3 дней. Этот инокулюк используют для инокулирования 16 л среды, содержащей растворимый крахмал (640 г), сульфат аммония (32 г), вторичный кислый Фосфат калия (16 г), натрийхлорид (16 г), сульфат магния (16 г), карбонат кальция (32 г), растворимый дрожжевой экстракт (6,4 г), сульфат железа (II) 7НгО (0,016 г),
5
0
5
71560059
сульфат цинка 7Н70 (0,016 г) и хлорид марганца (0,016 г), находящейся в двадцатилитровом Ферментере. Ферентируемую массу инкубируют при С при перемешивании со скоростью 250 об/мин и подают воздух со скоростью 15 л/мин. Спустя .24 ч добавляют натриевую соль тиофенгЗ-карбоновой : кислоты (1,6 г), такое добавление по25
30
10
вторяют через 48 и 72 ч, а Ферментацио продолжают в течение 120 ч. Далее мицелий удаляют фильтрованием и экстрагируют смесью аиетон:1н. соляная кислота (100:1,3x7 л). Получен- j5 ный экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при- пониженном давлении и экстрагируют метиленхлоридом (2 5 л) . Метиленхлоридный экстракт концентрируют досуха до получения неочи- 2Q щенного продукта в виде подвижного масла, которое растворяют в диэтило- вом эфире и вводят в колонну с сили- кагелем (1 кг). Эту колонну элюируют диэтиловым эфиром, собирая Аракции по 200 мл. Фракции 32-45 объединяют и растворитель выпаривают До получения частично очищенного материала. Полученный продукт растворяют в смеси метанола и воды (3:1) и хромато- графируют на колонне CIS Micro Bonda- pack (50 см) в высокоэ Ьфектив- ном жидкостном хроматографе, используя тот же растворитель со скоростью потока 100 мл/мин. Фракции 27-36, содержащие целевой продукт, объединяютf и повторно хроматографируют на CJ8 Zorbax ODS колонне (21 ммх25 см), элюируя смесью метанола и воды (3:3) со скоростью потока 9 .мл/мин. Соответствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формулы (1), где RJ - ОН, двойной связи нет, R - тиенил-3-ил, К, - CHj, a R. 4 - 4 -(альфа-2-олеанд- росил)-алыЬа-2-олеондросилокси (2) в виде белого порошка с т.пл. 167 С. Строение продукта подтверждено данными масс-спектрометрии следуюгаим образом.
Mace-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами проводят на масс-спектрометре VG модель 7070F, используя матрицу образца триэтилен- гликоля с твердьм найтрийхлоридом. (M+Na) наблюдается при га/е - 953 (теор. 953).
Mace-спектрометрию электронного удара проводят на масс-спектрометре
35
40
45
50
55
VG но 33 19
то 12
об ин ла др щу 30 ни ку ср ко п ва дл с ме п 35 1 ( н г ф ф ( к д же ци ца л м ш аэ р и п э л а п т к о ( с
8
VG модель 7070F. Значение т/е для основных фрагментов следующие: 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195,145, 127, 113, 95 и 87.
Пример 8. Вегетативную клеточную суспензию S-avermitilis NCIB 12121, хранившуюся при -60°С в 10%
5
0
5 Q
5
0
5
0
5
объем/объем водном (2 мл) глицерине, инокулируют в 50 мл среды, содержащей лактозу (1,0 г), барду (0,75 г) и дрожжевой экстракт (0,25 г), находящуюся в конической колбе объемом 30.0 мл, и инкубируют при 28°С и течение 24 ч при встряхивании. Затем ино- кулюм добавляют к 600 мл указанной среды, содержащейся в трехлитровой колбе, и полученную смесь инкубируют при 28°С в течение 24 ч при встряхивании. Полученный продукт используют для инокулирования 10 л указанной среды, находящейся в 1 6-литровом Лер- ментере, и инкубируют в течение 24 ч при 28 С и скорости перемешивания 350 об/мин при аэрации со скоростью 10 л/мин. Эту ферментируемую массу (600 мл) используют для инокулирования 16 л среды, содержащей частично гидролизованный крахмал (640 г), сульфат аммония (32 г), вторичный кислый фосфат калия (16 г), натрийхлорид (16 г), сульфат магния 7Н40 (16 г), карбонат кальция (16 г), растворимый дрожжевой экстракт (6,4 г), сульфат железа (II) 7Н20 (0,016 г), сулыЪат цинка (0,016 г) и хлорид марганца (0,OJ6 г), находящейся в 20- литровом ферментере. Ферментируемую массу инкубируют при 28°С при перемешивании со скоростью 350 об/мин и аэрируют со скоростью 15 л/мин. Через 24 ч добавляют натриевую соль циклобутанкарбоновой кислоты (1,6 г) и такое добавление повторяют через 48 и 72 ч инкубирования, и Лерментацию продолжают в течение J20 ч. После этого промежутка времени мицелий уда- ляют фильтрованием и экстрагируют ацетоном ( л). Этот экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном давлении и экстрагируют метиленхлоридом (2x5 л). Уетиленхлорид конденсируют досуха до получения неочищенного продукта в виде подвижного масла. Его помещают в изооктан (150 мл), и раствор экстрагируют смесью метанола (95 мл) и воды (5 мл). После выпаривания метанольного экстракта получают частично очищенный ма
териал, который разделяют на индивидуальные компоненты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии следующим образом.
Полученный остаток растворяют в небольшом количестве метанола и хроматограф ир уют на колонке С18 Micro- Bondapack (50 мм«50 см} на высокоэффективном жидкостном хроматографе, используя смесь метанол/вода (4:1) со скоростью потока 100 мл/мин. Фракции -4 объединяют и используют в примере 9, фракции 5-9 объединяют и используют в примере 10, Фракции 1.0- 19 объединяют и используют в примере 1 1, а фракции 20-35 объединяют и используют в примере 12.
Пример 9. Получение 25-иик- лобутил-авермектин В2 (R, ОН, ).
Объединенные фракции 1-4 из примера 8 выпаривают досуха и остаток повторно хроматографируют на колонке CIS Zorbax ODS (21 см), элюи- руя смесью метанола и воды (3:1) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют, растворитель выпаривают и полученный продукт подвергают окончательной очистке на колонке (10,5 см), элюируя сме сью метиленхлорида и метанола (98:2) со скоростью потока 4 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формулы (I), где Ц - ОН, двойной связи нет, R - циклобутил, RS - Н, a R4- 4 -(альфа-г-олеандро- сил)-альфа-г олеандросштокси (2) в виде белого порошка с т.пл. 1JO-112°C
Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Face-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами проводят на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца триэтилен- гликоля с твердьм натрийхлоридом (М+ +Na) наблюдают при т/е 91J (теоретически 91 i).
Mace-спектрометрию с электронным ударом осуществляют на масс-спектрометре VG модель 707OF. Значения ,щ/е для основных фрагментов: 321, 303, 26J, 257,237, 219, 209, J 91 f JJ9,
167,145, J27, J13, 1JI, 95 и 87.
Пример 10. Получение 25-цик- лобутип-авермектин А2 (R OH, )
Объединенные фракции 5-9 из примера 8 выпаривают досуха, а остаток
10
20
jc
25зо .
л 35
45
50
.
60059Ю
хроматограсЪируют дважды на к.чпнке CIS Zorbax ODS (21 ммх25 см), элюи-- руя смесью метанолг. и воды (77:25) го скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие Фракции объединяют к Гчгаа ива- ют до получения соединения формул;, (1) , где Rf- ОН,двойной связи нет, R - циклобутил, Кэ - СН3, а К 4 - 4--(аль- фа- -олеандросил) -альсЬя -2,- эпеандрос 1- локси (2) в виде белого порошка с т.пл. 135-14 0°С.
Строение продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Масс-спектрометриго с бомбардировкой быстрыми электронами осупествл пот на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца триэтилен- гликоля с твердьм натрийхлооидом (М+ +Na)+ наблюдают при т/е 925 (теоретически 925) .
Насс-спектрометрию электронного удара осуществляют на ь сс-спегтро- метре VG модель 7070F. Значения т/е для основные Фрагментов след.юнце: 596, 454, 321, 303, 275, 237, 219, 191,179, 167, 145, 127, 133, ill, 95 и 87.
Пример И. Получение 25-uhK лобутил-авермектин В1 (имеется 22,23 двойная связь, R3 Н).
Объединенные фракции 10-19 из примера 8 выпаривают досуха, а остаток растворяют в метаноле и хроматографируют на колонке С18 Zorbax ODS, элюн- руя смесью метанола и воды (4:1) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют ,а растворитель выпаривают до получения продукта, который повторно хроматографируют на колонке Silica Zorbax SIZ (21 мм 25 см) , элюируя смесью дихлррметана и метанола (98,5:1,5) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формулы (1), где R отсутствует, двойная связь имеется, R г - циклобутнп, R3 - Н, aR4- 4 -(алы а -олеандро- сил)-альфа-олеандросилокси, в випе белого порошка с т.пп. . Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Mace-спектрометрию с бомбардировкой быстрым - электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца три11
,5
15
этиленгликоля и твердом натрийхлори- дом (M+Na)+ наблюдается при т/е 898 (теоретически 803)
Mace-спектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектромет ре VG модель 7070Е. Значения та/е для основных фрагментов следующие: 303, 261, 257, 219, 391, 1 $7, Л27, 113, 111, 95 и 87. tO
Пример 12. Получение 25-цик- лобутил-авермектин А1 (имеется двои- ная связь 22,23 RS СН3).
Объединенные фракции 20-35 из при- мера 8 выпаривают досуха и остаток хроматограФируют на колонке С18 Zor- Ъах ODS (21 см) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют, растворитель выпаривают и полученный продукт повтор- Q но хроматографируют на колонке Silica Sperisorb 5 мкм (10,5 мм«25 см), элюируя смесью дихлорметана и метанола (98,5:1,5) со скоростью потока 4 мл/мин.
В результате объединения соответствующих фракций с последующим выпариванием получают соединение формулы (1), где R отсутствует, двойная связь имеется, Иг - шклобутил, R- андросилокси,
12 в виде белого порошка
25
с т.пл. 131-5 С.
Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Mace-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, использ-уя штрицу образца три- этиленхликоля с твердым найтрихлори- дом (M+Na)1 наблюдают при We 951 (теоретически 951.) .
. Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют, используя масс- спектрометр VG модель 7070F. Значения т/е для основных Фрагментов: 624,480, 347, 329, 375, 263, 245, 235, 217, 205,193, 179, J45, 127, 113, 111, 95 и 87.
Пример 14. Получение 25-цик- логексил авермектин А2.
Воспроизводят среду и условия примера 1 за исключением того, что в качестве субстрата используют натоиевую соль циклогексанкарбоновой кислоты до получения соединения формулы (1),где R,, - ОН, R - циклогексил, R-J - СН,, a R. - 4 -(альфа-олеандроксил)-алъЛаСН3, a Rq 4-(альфа-Z-олеандросил)- алъфа -олеандросилокси, в виде белого порошка с т.пл. 120-124°С. Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Масс-спектрометрио с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца три- этиленгликоля с твердым натрийхлори- дом. (M+Na)+ наблюдают при т/е 907 (теоретически 907).
Mace-спектрометрию электронного удара осуществляют на м асс-спектро- метре VG модель 707OF. Значение т/е для основных фрагментов: 578, 303, 2755 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113,1 П , 95 и 87.
Пример 13. Долучение 25- (циклогекс-3-енил)авермектин А2.
Воспроизводят среду и условия примера 1 за -исключением того, что в качестве субстрата используют натгае- вуют соль 3-циклогексановой кислоты до получения соединения формулы (1), где R,, - ОН, двойной связи нет, циклогекс-3-енил, R3 - СН3, a R 35
40
Rl3Q Z-олеандросилокси, в виде белого порошка с т.пл. П2-117°С.
Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Масс-спектрометрига с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца три- этиленгликоля с твердьм натрийхлори- дом. (H-Wa) наблюдают при т/е 953 (теоретически 953).
Mace-спектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значения т/е дс для основных фрагментов: 624,482, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207,195, 179, 145, 127, 113, 111, 96 и 87.
Пример 15. Получение 25-(1- метилтиоэтил)авермектин А2.
Воспроизводят среду и условия примера 1 за исключением того, что в качестве субстрата используют натриевую соль 2-метилтиопропионовой кислоты до получения соединения формулы (1),где R,, - ОН, R.Ј - 1-метилтиоэтилом, RJ 50
55
СНЭ, a R4 - 4 -(альфа-г-олеандроксил)- альфа-г-олеандроксилокси в виде бело- 4( -(алъфа- -олеандросил) -альфа-Z-оле- го порошка с т.пл. 134-138°С.
1560059
андросилокси,
12 в виде белого порошка
5
15
tO
Q
25
с т.пл. 131-5 С.
Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Mace-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, использ-уя штрицу образца три- этиленхликоля с твердым найтрихлори- дом (M+Na)1 наблюдают при We 951 (теоретически 951.) .
. Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют, используя масс- спектрометр VG модель 7070F. Значения т/е для основных Фрагментов: 624,480, 347, 329, 375, 263, 245, 235, 217, 205,193, 179, J45, 127, 113, 111, 95 и 87.
Пример 14. Получение 25-цик- логексил авермектин А2.
Воспроизводят среду и условия примера 1 за исключением того, что в качестве субстрата используют натоиевую соль циклогексанкарбоновой кислоты до получения соединения формулы (1),где R,, - ОН, R - циклогексил, R-J - СН,, a R. - 4 -(альфа-олеандроксил)-алъЛа
Z-олеандросилокси, в виде белого порошка с т.пл. П2-117°С.
Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом.
Масс-спектрометрига с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца три- этиленгликоля с твердьм натрийхлори- дом. (H-Wa) наблюдают при т/е 953 (теоретически 953).
Mace-спектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значения т/е для основных фрагментов: 624,482, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207,195, 179, 145, 127, 113, 111, 96 и 87.
Пример 15. Получение 25-(1- метилтиоэтил)авермектин А2.
Воспроизводят среду и условия примера 1 за исключением того, что в качестве субстрата используют натриевую соль 2-метилтиопропионовой кислоты до получения соединения формулы (1),где R,, - ОН, R.Ј - 1-метилтиоэтилом, RJ
СНЭ, a R4 - 4 -(альфа-г-олеандроксил)- альфа-г-олеандроксилокси в виде бело- го порошка с т.пл. 134-138°С.
Строение полученного продукта подтверждено масс-спектр метрически следующим образом.
Маес-спектрометрию с бомбардиров-- кой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца три- этиленгликоля с твердым натрийхлори- дом, (M+Na) наблюдают при т/е 945 (теоретически 945).
Уасс-спектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значение тл/е для основных фрагментов 341, 323, 275, 257, 239 2JI , J79, 187, 145, 127,ПЗ, JJJ, 95 и 87.
Пример 16. Получение 26-(2- метилциклопропил)авермектин А2,
Воспроизводят среду и условия примера 1 за .исключением того, что в качестве субстрата испоггьзуют натриевую соль 2-метилциклопропанкарбоновой кислоты до получения соединения Лор
мулы (1), где циклопропил,
Ri Кз ОН, Кг - 2-метил- CHj, R4 - 4-(альфа-Z-олеанд рос ил) -альфа-Z-олеандро- ксилокси, в виде белого порошка с т.пл. 147-150°С.
0
0
5
5
вая, 2-метилпектановая, 2-пикл--про- пклпропионовая, ииклогехтанкарОо) о- вал, 4,4-дифторциклог ксанкапбоновая, 4-метиленциклогексанкарбоновая, 3-ке тилциклогексанкарбоновая, ииклопен- тен- -карбоноват, 1-циклогексенкарбо- новая, тетparидролИран-4-карбонIB я тиофен-2-карбоновая, 3™лерилуксусная и 2-хлор-тио(Ьен-4-карбоновал.
Пример 18. Получение 25-цик лобутил-22,23-дигидроавсрмектин В1.
Продукт примера 1 1 в бензоле гидрируют в присутствии трис(тригЬенил- фосфин)ргций хлорида по способу ЕРА- А--0001689 до получения соответствующее соединена Формулы (1), где является Н, а двойной связи нет.
Пример 20. Жидкая композиция.
Продукт, полученный по способу любого из предшествующих примеров, ра-- створяют в попиэтиленгликоле (средний молекулярный вес 300) до получения раствора, содержащего 400 мкг/мл, для применения в качестве жидкой композиции.
Пример 21. Противогельминт- ную активность оценивают против Сае
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Штамм STREPTOMYCES AVERMITILIS NC1B 12121 культивируют в питательной среде в присутствии карбоновой кислоты R2CO2H или ее натриевой соли, или ее метилового эфира, где R2 - альфа-разветвленный C3-C8-алкил, при условии, что не изопропиловый или вторично-бутиловый, алкенил, алкинил, алкоксиалкил или алкилтиоалкиловая группа, или C5-C8-циклоалкилалкиловая группа, в которой алкиловая группа представляет альфа-разветвленную алкильную группу C2-C5, или C3-C8-циклоалкил, или циклоалкиниловая группа C5-C8, при этом любой из них может замещаться метиленом или одной или более алкиловой группой C1-C4, или галоатомами, или тиенилгруппа, в условиях аэрации и перемешивания. После ферментации выделяют целевой продукт, где R1-OH и отсутствует двойная связь в положении 22-23, или есть двойная связь и отсутствует R1, и при необходимости последнее соединение восстанавливают до получения целевого продукта, где R1-H и отсутствует двойная связь, R3-H или CH3,R4-41 (альфа-Z-олеандрозил)-альфа-Z-олеандрозилоксигруппа. Полученные соединения обладают противопаразитарной активностью широкого спектра действия. 5 з.п.ф.
Строение полученного продукта под- 30 norhab ditis elegans, используя in
vitro тест скринирования. Продукты примеров 1, 7, 9-16 убивают 100% чер вей в концентрации 0,1 мгкл/мл.
т ерждено масс-спектрометрически следующим об ра э ом.
Jiacc-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 707ОЕ, ИСПОЛЬЗУЯ матрицу образца три- этиленгликоля с твердым натряйхлори- дом, (M+Na)4 наблюдают при га/е 925 (теоретически 925) .
Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значение т/е для основных фрагментов: 596, 454, 303, 275, 237, 219, 209, 191, 179, 167,U5, 127, 113, 111 , 96 и 87.
Пример 17. Воспроизводят способ по примеру J за исключением того, что в качестве субстрата вместе циклопентакарбоновой кислоты используют натриевые соли следующих карбо- новых кислот, до получения соответствующих 25-замещенных авермектинов формулы (1), где Rf - ОН, двойной связи нет, или где имеется двойная связь, а Т1, отсутствует, R , - Н или ОН, a 4 -(альсЬа -олеандросил) - , альфа-Z-олеандросплокси: 2-метилва- лериановая, 2,3-диметилмасляная, 2- метилгексановая, 2-метилпент-4-ено-
norhab ditis elegans, используя in
vitro тест скринирования. Продукты примеров 1, 7, 9-16 убивают 100% чер вей в концентрации 0,1 мгкл/мл.
Пример 22. Инее тицидная активность .
Активность против взрослой домашней мухи Musca domestica демонстрируют, используя стандартную тестовую методику, в которой мух анестезируют двуокисью углерода и О,I мкл ацетона, содержащего тестовое соединение, помещают на торакс самок мух. Продукты примеров 1,7 и 9-16 .все убивают 100% обработанных мух в дозах 0,01 мкг на муху.
Использование способа позволяет получать препараты, обладающие проти- вопаразитическим действием широкого, спектра. Формула изобретения
J. Способ получения производного авермектина общей формулы I
к,
СН3
CHS
151560059
пунктирная линия в положении 22зt т
10
3 представляет возможную двойную вязь;
Rt - Н или ОН и отсутствует двой- ная связь в положении 22-23 или двойная связь присутствует и отсутствует
R-t альфа разветвленный С3-С«- алкил при условии, что не изопропиповый или вторично- бутиловый, алкенип, алкинил, алк оке нал к ил, ил-и алкилтио- алкиловая группа, ийи ииклоалкилалкиловая группя, в которой алкиловая группа представляет альфа разветвленную С -С -алкиловую группу, или Cj-C.-циклоалкил, или С J.-C g-циклоалкиниловая jn группа, при. любой ид них может замещаться метиленом или одной или более С,, -С 4,-алк илов ым и г руппами, или галоатомами, или тиенил- 25 группа,;
R3 - Н или СН э;
R4 - 4 -(/-г-олеандрозил)/-2олеандрозилоксируппой формулы30
16
5
0
5
заключающийся в- том-, что штамм Strep- tomyces avermitilis NCIB 12121 культивируют в питательной среде в присутствии карбоновой кислоты общей
°PMy™R,C02H,
или ее натриевой соли, или ее метилового эфира, и выделяют целевой продукт общей формулы I, где R 1 - ОН и отсутствует двойная связь в положении 22-23 или есть двойная связь и отсутствует Rf, и при необходимости последнее соединение восстанавливают До получения целевого продукта, где R - Н и отсутствует двойная связь.
П р и о р и т там:
ет по пунк
