Способ получения авермектина В Советский патент 1993 года по МПК C12P17/08 C12P17/08 C12R1/465 

ел

с

либо во время инокуляции, либо через некоторые промежутки времени во время ферментации. Продуцирование авермекти- новых продуктов можно контропировать путем отбора проб из ферментационной среды, проводя экстрагирование органическим растворителем с последующим определением продукта методом хроматографии, например, используя жидкостную хроматографию высокого давления. Инкубацию проводят до тех пор, пока выход продукта не будет максимальным, в общем в течение 4-15 дней.

Предпочтительное количество затравочных соединений в каждом случае добавления (карбоновая кислота или соединение, превращающееся в нее) составляет 0,05- 3,0 г на 1 л. Затравочное соединение можно добавлять в ферментационную среду непрерывно, через некоторые промежутки времени или однократно. Кислоту (RCOOH) добавляют как таковую или в виде соли кислоты, такой как соль натриевая, литиевая или аммониевая, или как соединение, превращающееся в кислоту. Кислоту, если она существует в виде твердых частиц, по пред- почтительному варианту растворяют в подходящем растворителе, таком как вода или (С1-Со)-спирты.

Среды, которые используют для ферментации, могут представлять собой, в осо- бенности когда С-25 заместителем является изопропил или (5)-8тор,бутил, общепринятые среды, содержащие усваиваемые источники углерода, азота и следы элементов. Когда С-25-заместитель-ненатуральная группа, т.е. она не является изопропилом или (5)-втор, бутилом, то ферментационная среда является такой, в которой выбранные ингредиенты не содержат или содержат только минимальные количества затравоч- ных соединений, в которых R-изопропил или (5)-втор. бутил.

После ферментации в течение нескольких дней при температуре предпочтительно в интервале 24-33°С ферментационный бульон центрифугируют или фильтруют, и мицелиевый осадок экстрагируют, предпочтительно ацетоном или метанолом. Экстракт в растворитель концентрируют/в целевой продукт затем экстрагируют в не смешивающийся с водой органический растворитель, такой как хлористый метилен, этилацетат, хлороформ, бутенол или мети- лизобулкетон. Экстракт в растворителе концентрируют, и сырой продукт далее очищают до необходимой степени хрома- тографией, например, используя препара- тивную хроматографию с обращенной фазой, жидкостную хроматографию высокого давления.

Продукт обычно получают в виде смеси соединений формулы (I), где Р2-4-(альфа-1.- олеандрозил)-альфа-Ьолеандрозилокси, RI- ОН, и двойная связь отсутствует, или отсутствует RI, а двойная связь присутствует, и где Ra-H. Соединения, в которых Ra-CHa, no-существу, отсутствуют. Однако пропорции каждого соединения могут соединяться в зависимости от использованного конкретного мутанта и затравочного соединения, а также условий проведения.

Источники группы R, т.е. то, происходит ли она непосредственно от R-OOH, или ее получают из одного из упомянутых предшественников, или из любого предшественника, не является существенным для получения авермёктинов. Существенным требованием для процесса согласно изобретению для их получения является то, чтобы нужная группа R была доступна штаммам Str.avermitllis согласно изобретению в процессе ферментации.

Подходящими являются следующие соединения:

2,3 - диметилмасляная кислота;

2 - метилгексановая кислота;

2 - метилпент-4-еноевая кислота;

2 - циклопропиллропионовая кислота;

литиевая соль 4,4 - дифторциклогексан- карбоновой кислоты;

4 -.метиленцикдогексанкарбоновая кислота;

3 -метилциклогексанкарбоновая кислота (цис/транс);

1 - циклопентенкарбоновая кислота;

1 - циклогексенкарбоновая кислота;

тетрагидропиран - 4-карбоновая кислота;

тиофен - 2-карбоновая кислота;

3 - фурокислота;

2 - хлортиофен-4-карбоновая кислота;

циклобутанкарбоновая кислота;

циклопентанкарбоновая кислота;

. циклогексанкарбоновая кислота;

циклогептанкарбоновая кислота;

2 - метилциклопропанкарбоновап кислота;

3 - цмклогексен-1-карбоновая кислота; 2. - метилтиопропионовая кислота; 2 - метил-4-метоксимасляная кислота; тиофен - 3- карбоновая кислота; гидроксиметилциклопентан; 3-тиофенкарбоксальдегид; 3-циклогексилпропионовая кислота; З-циклопентилпропионовая кислота; гидроксиметилциклобутан; тетрагидротиофен-3-карбоновая кислота; З-циклопентил-1-пропанол; литиевая соль 3-метилциклобутанкар- боновой кислоты;

3-фторциклобутанкарбоновая кислота;

литиевая соль 3-метилленциклобутан- карбоновой кислоты;

2-метил-4-метилтиомасляная кислота;

тетрагидротиопиран-4-карбоновая кислота;

циклобутилметиламин;

этилциклобутанкарбоксилат;

4-гидроксиметилциклопентен; этиловый эфир 2-(3-тиофенкарбонил) пропионовой кислоты;

5-2-метилпентановая кислота; R-метил- пентановая кислота..

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Получение двойного мутанта Stavermitills 7881 (АТСС 53692) с недостающими разветвлен но-2-оксокислотодегидроге- назой и В-авермектин-0-метилтрансфе- разой.

Стадия 1. Исходный штамм Str. avermitllis АТСС 53567 выращивают в виде сливного слоя на агаре New Patch. Agar в течение 12 дней при 30°С.

Споры собирают с трех таких чашек и суспендируют в 20 мл 0,05М трис-малеино- кислотном буфере, рН 9.

Среда New Patch.Agar имеет следующий состав:

V - сок 200 мл СаСОз 3 г Агар 15 г Н20 до 1000мл Питательный бульон 1,0 г/л Ацетат натрия-ЗНгО 1,4 г/Л Изовалериа новая кислота 50 мг/л Изомасляная кислота 50 мг/л Метилмасляная кислота 50 мг/л Изолейцин 250 мг/л Лейцин 250 мг/л Валин . 250 мг/л Раствор микроэлементов 1 мл/л

Смесь из 8 растительных соков (помидоры, морковь, сельдерей, свекла, петрушка, латук, горчица и шпинат) плюс соль, аскорбиновая и лимонная кислота и натуральные вкусовые добавки.

Состав раствора микроэлементов: РеС1з-6Н202,7 г MnSOrHaO 4,2 CuSCU-SHaO 0,5 CaCl2 11,0 Н2РОз 0,62 CaCl2 6H20 0,24 ZnCI2 0,62 Na2Mo04 0,24

Вышеупомянутое растворяют в 1 л 0,1 HCI.

Стадия 2.10 мл споровой суспензии добавляют в ампулу, содержащую 10 мг N-меTHfl-N -HHTpo-N- нитрозогуанидина (НТГ). Ампулу инкубируют на шейкере при 28°С 60 мин, затем тщательно промывают раствором 1 % NaCI.

Стадия 3. Промытые споры суспендируют в 1% растворе NaCI и смешивают с равным объёмом 80% этиленгликоля. Суспензию хранят при -20°С и используют в.качестве источника клеток для скрининга мутантов.

Эту споровую концентрированную массу распределяют по чашке УРД (дрожжевой пептидно-декстрозный агар) для получения около 100 колоний на чашку. Колонии

мутагенизйрованой популяции (обработанной нитрозогуанидином) исходного Str, avermitllls АТСС 535567 собирают и наносят в виде мазков на агаровую среду, полученную следующим образом (граммы на литр):

разбавленный крахмал 80,К2НРСм 1, MgS04 7H20 1, ардамин рН 5, СаСОз 5, Р- 2000 1 мл, FeS04-7H20 0.01; МпС 2-4Н20 0,001. ZnS04 7H20 0,001; бактоагар 17, дистиллированная вода до 980 мл, рН среды

добавляют до 7, добавляя NaOH перед авто клавированием при 121°С в течение 20 мин. После автоклавирования добавляют 20 мл 5% концентрированного раствора (±)-2-ме- тилмасляной кислоты, рН 7.

Агаровые культуры инкубируют в течение 8-12 дней при 28°С. Клетки (мицелий) удаляют с поверхности агара, помещают в 250 млк ацетона. 25 мкл ацетоновых экстрактов затем наносят точками на хроматографические пластины Analtech Silica Gel GF.

Храмотограмму снимают в течение 30- 40 мин этилацетатом в качестве растворителя, затем сушат, затем обрабатывают 5%

ванилином в этаноле. Пластины помещают в печь при 100°С на 1-3 мин, затем обрабатывают 3% серной кислотой в этаноле и вновь помещают в печь при 100°С на 10-15 мин. Мутанты, лишенные В-авермектин-0метилтрансферазы, идентифицируют по изменению на хроматограмме: по присутствию пятна, соответствующего В-авермек- тиновым компонентам (R f %. 0,54; 0,42 для В1 и 82 соответственно) и отсутствию пятна, соответствующего А-авермектиновым компонентам (Rf - 0,69; 0,58 для А1 и А2 соответственно).

Общие методики высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Подвижная фаза: 150 мл воды, 70 мл ацетонитрила, добавляли метанол до получения объема 1л.

Колонка: типа Ultra Sphera ОД5 25 см (Beckman Instrum. Фуллертон, СА 926343100).

Поток: 0,75 мл/мин.

Детектирование: УФ на 24, нм.

Ослабление: около 6.

Разбавитель образца (О): 35 мл ацето- нитрила плюс 390 мл метанола.

Стандарты 0,5 мг авермектина А2А в колбу емкостью 10 мл и довести метанолом до нужного объема; навесить 0,5 мг испыту- емого продукта в колбу емкостью 10 мл и довести до полного объема метанол.

Они представляют собой стандартные концентрированные растворы: для стзндар- тного раствора:

взять 100 мкл и 100 мкл в ампулу и добавить 800 мкл подвижной фазы.

Пробы: отобрать 1 мл хорошо перемешанного бульона; удалить возможно боль- ше надосадочной жидкости, не затрагивая осадок; добавить 100 мкл воды после высокоэффективной хроматографии к осажденному слою и провести вихревое смешивание для диспергирования; добавить 2 мл разбави- теля и тщательно перемешать; профильтровать и подвергнуть высокоэффективной жидкостной хроматографии,

Натуральные и ненатуральные авермектины по изобретению подвергают высоко- эффективной жидкостной хроматографии и время удерживания для пиков отдельных авермектинов делят на время удерживания для наблюдаемого присутствующего олиго- мицина-А, служащего в качестве внутренне- го стандарта для данного определения методом БЗЖХ. Олигомицин-А почти всегда наблюдают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в виде побочного продукта ферментации Str.avermltilis и он является единственным продуктом, наблюдаемым с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, который продуцируется описываемыми мутантами, когда их культивируют в среде, свободной от кислот RCOOH, где R имеет определенное значение, Обычно олигомицин-А имеет время удерживания 12,5-14 мин. Отношение удерживания (НУ) является более значимой основой для идентификационного сопоставления и сравнения выходов авер- мектиновых продуктов. Общий порядок появления авермектиновых продуктов при высокоэффективной тонкослойной хроматографии - В2, А2, В1 и А1.

Натуральный авермектин

В2в В2а А2в А2А В1в В1А А1в А1а

енатуральные авермектины

Время удерживания/ Время удерживания(олигомицин А)

070

0,84

0,90

1,09

1,40

1,83

1,83

2,42

Время удерживания/ Время удерживания(олигомицин А)

циклопентил В20,94 циклопентил А2 1,23 циклопентил В1 .1,99 циклопентил А1 2,62

Время удерживания колеблется в пределах 1-2 мин в разные дни, причем время удерживания олигомицина А, по-видимому, составляет 12,5-15 мин.

В следующих примерах авермектины определяют с помощью описанной процедуры высокоэффективной жидкостной хроматографии, за исключением случаев, которые оговорены особо.

Составы использованных сред в следующих примерах представлены ниже.

Среда А7 г/л Разбавленный

крахмал20 Ардамии рН в 05 Фармамедиа с 15 СаСОз 2, а приготовленный гидролизом крахмала аль- фаамилазной из Bacillus fldenlformis (продукт фирмы) Novo Enrym, Уилтон, КТ, поставляется под товарным знаком Termamy до декстрозного эквивалента 40% ±5%. Вот Yeas + Products, Jnc., Клифтон. Н.Дж 07012

Сот Traders Protein, Мемфис, Теннеси 38108 Добавляли NaOH, рН доводили до 7,2 Среда АР - 5г/л разбавленный

крахмал80 Ардамин рН 5

К2НР041

MgSO/r7H201

NaCI1

СаСОз7

FeS04-7H200,01

MnCM-7H200.001

СН3СНЭ

СН30 СН3

где R-альфа-разветвленный Сз-Се-алкил, алкенил, алкинил, алкоксиалкил или алкил- тиоалкильная группа, в которой алкильная группа представляет собой альфа-разветв1 ленную Сз-Св-алкильную группу, Сз-Св-цик- лоалкильную или Сз-Св-циклоалкетильную группу, любая из которых может быть необязательно замещена метиленовой одной или более С1-С4-алкильными группами или атомами галогена путем культивирования в

0

5

аэробных условиях продуцента вида Streptomyces avermitllis в водной среде, содержащей усваиваемый источник азота, углерода и неорганических солей в присутствии карбоновой кислоты RCOOH, где R имеет указанные значения, и выделения целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Str.avermitllls ATCC 53692. а культивирование проводят при 28-30°С.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что R 3-6-членное кислород- или серу- содержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным или полностью или частично ненасыщенным.

Область использования: микробиологическая промышленность, производство антибиотиков. Сущность изобретения: авермектииы В получают при культивировании штамма Streptomyus avermltills АТСС № 53692 в питательной среде в присутствии кэрбоновой кислоты. Используемый штамм является двойным мутантом с отсутствием разветвленно-2-оксокислотнб- дегидрогеназной и В-авермектин-0-метилт- рансферазной активностей. Полученные авермектины В обладают противопарази- тарной активностью широкого спектра действия, 1 з.п,ф-лы.