Способ микроклонального размножения лиственницы Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к проблеме клональ- ного микроразмножения лесных древесных растений для воспроизводства ценных хвойных пород в лесном хозяйстве.

Целью изобретения является увеличение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения.

Способ состоит в том, что в качестве исходных эксплантатов используют покоящиеся (зимние) апикальные почки не менее 3 мм в диаметре, которые вводят в среду Литвей с добавлением 0,5-1,5 мг/л 6-БАП и 0,5-2,0 мг/л кинетина (среда 1) для инициации пазушных почек, после чего диски с пазушными почками переносят на лишенную фитогормонов среду Соммера (среда 2) для формирования конгломерата пазушных побегов с последующим разделением и субкультивированием на той же среде с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей, содержащей 20-50 мг/л мочевины

(среда 3), для стимуляции удлинения побегов.

Способ осуществляется следующим образом.

С одревесневших годичных побегов срезают черенки длиной 10-15 см, несущие апикальную почку диаметром не менее 3 мм. Сбор материала проводят в период с октября по апрель Возможность хранения одревесневших черенков в течение длительного времени под снегом, а также в холодильных камерах обеспечивает круглогодичное проведение работ Верхушечные части черенков отрезают, обмывают в слабом мыльном растворе и прополаскивают в проточной воде. Подготовленный таким образом материал стерилизуют сначала в течение 2 мин в 70%-ном водном растворе этилового спирта, затем 15 мин в 5%-ном водном растворе гипохлорита кальция и трижды промывают стерильной дистиллированной водой В стерильных условиях (шкафу с ламинарным течением возсл С

сл

XI

о

С Јь

духа)удаляют покровные чешуи с верхушечной почки и выделяют зачаточный побег, несущий меристему и листовые примордии. Изолированные эксплантаты помещают на агаровую питательную среду 1 в биологические пробирки или колбы. Среда 1 содержит минеральные соли, витамины, мезоинозит, а также 2% сахарозы, 0,6% агара и гормональные вещества: 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 0,5-1,5 мг/л и кинетин 0,5-2 мг/л (табл.1). В течение 4-7 недель на этой среде (у 53-81% эксплантатов) происходит инициация пазушных почек, что выражается в набухании исходной почки, разрастании ее в ширину и образовании светло-зеленого диска диаметром до 10 мм. Полученные таким образом диски переносят на питательную среду 2, представляющую собой модифицированную по минеральному составу среду Соммера, лишенную регуляторов роста (табл.1). На этой среде в течение 4-5 недель происходит рост инициированных пазушных почек с образованием конгломерата коротких побегов длиной 1-3 мм (в среднем 16,7 побегов на 1 эксплантат). Сформированный конгломерат разделяют под микроскопом и каждый побег помещают на среду 3, являющуюся ди- люированной вдвое по минеральному составу средой 2, к которой добавлена мочевина в концентрации 20-50 мг/л (табл.1). На этой среде происходит удлинение побегов, которые в течение 4-7 недель достигают длины 6-10 мм. Полученные таким образом побеги морфологически пригодны для стимуляции ризогенеза на укоренительных средах. Процесс клонирования составляет 85-130 дней от момента введения эксплантатов в культуру до получения удлиненных побегов.

В табл,1 представлены среды, используемые для клональной мультипликации ли- ственницы в культуре изолированных вегетативных почек in vitro.

П р и м е р 1. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в 3 срока: ноябре, феврале, апреле с 20-23-летних деревьев лиственницы Сукачева различного географического происхождения (30 клонов). Часть черенков, собранных в ноябре и феврале, находится под снегом (5 мес) и в холодильнике при 3°С (2 мес), после чего их используют для взятия эксплантатов. Наиболее крупные апикальные почки (5-6 мм) после стерилизации и удаления покровных чешуи культивируют последовательно на питательных средах 1, 2 и 3 со следующими оптимальными концентрациями добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, мочевина 30 мг/л. Культуры выращивают на

светоплощадке при 16-часовом фотопериоде (освещение люминесцентными лампами 2000-500 лк) при 26°С днем и 22°С ночью. Продолжительность культивирования на

каждой из сред варьируют в зависимости от клонов от 4 до 6 недель. Различия в характере мультипликации в зависимости от сроков взятия и продолжительности хранения черенков не являются существенными

0 (табл.2). Средняя эффективность образования дисков с пазушными почками (инициация пазушных меристем) 75%, среднее число побегов на 1 эксплантат 18,7, а максимальное 25, средняя длина побегов после

5 удлинения 8,4 мм. Продолжительность процесса мультипликации 12-17 недель.

П р и м е р 2. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в ноябре и апреле с 20-23-летних деревьев (20

0 клонов). Апикальные почки распределяют наЗ группы по их размерам: мелкие(1-2 мм), средние (3-4 мм) и наиболее крупные (5-6 мм), затем культивируют отдельно при тех же условиях, что в примере 1. Результаты

5 приведены в табл.3.

Таким образом, для культивирования целесообразно использовать почки размером не менее 3 мм.

П р и м е р 3. Растительный материал

0 черенки длиной 15 см заготавливают в ноябре, феврале с 20-летних деревьев (20 клонов). Культуры почек выращивают на среде 1 с различными концентрациями гормональных веществ. В ходе экспериментовус5 тановлены предельные значения и оптимальные концентрации.БАП и кинети- на. Результаты представлены в табл.4 и 5 соответственно.

П р и м е р 4. Растительный материал, как в примере 1. После культивирования на средах 1 и 2 полученные множественные микропобеги отделяют и субкультивируют индивидуально на среде 3 с различными концентрациями мочевины с целью удлине5 ния. Экспериментально определены предельные значения и оптимальные концентрации мочевины. Результаты представлены ниже.

Концентрация мо-Средняя длина

0чевины, мг/лпобегов,мм

206,1

308,4

505.7

П р и м е р 5. Черенки длиной 10 см

5 заготавливают путем отстрела в 100-летних естественных насаждениях лиственницы Сукачева, принадлежащих к двум популяциям (20 клонов). Через 5 дней после сбора апикальные почки диаметром 3-4 мм вводят в культуру (после удаления покровных чешуй) и выращивают последовательно на питательных средах 1-3 с оптимальными концентрациями добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, мочевина 30,0 мг/л. Культуры помещают в термосветоклиматокаме- ру при тех же условиях, что в примере 1, но освещенность поддерживают на уровне 25000 лк. Эффективность образования дисков варьирует между клонами и составляет в среднем 55%, число формирующихся по- бегов изменяется от 13 до 14, а в среднем 8,3, средняя длина побегов к концу удлинения 6,2 мм. Продолжительность процесса мультипликации 16-18 недель.

Преимуществами изобретения являют- ся: возможность микроклонирования взрослых элитных деревьев лиственницы (до 100 лет включительно), относящейся к числу наиболее ценных трудноразмножаемых хвойных пород; идентичность растений-ре- генерантов и донорского дерева по генотипу вследствие мультипликации, через пазушное побегообразование; высокая степень мультипликации (до 25 побегов на эксплантат), ранее достигаемая только на лиственных древесных породах; эффективное удлинение побегов (до 6-10 мм); простота подготовки и хранения растительного материала перед введением в культуру (отсутствие гормональной и прочей обработ- ки); быстрота процесса, занимающего от

момента введения эксплантатов в культуру до получения удлиненных побегов 85-130 дней; возможность круглогодичного проведения работ.

Формула изобретения Способ микроклонального размножения лиственницы, включающий посадку эксплантатов на питательную среду, культивирование, получение регенерантов и адаптацию их к условиям открытого грунта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода размножаемых растений и ускорения процесса размножения, в качестве эксплантатов используют покоящиеся апикальные почки диаметром 3 мм и более, а культивирование осуществляют в три этапа, при этом на первом этапе - инициации морфогенеза пазушных п очек - культивирование ведут на среде Литвей, в которую вводят дополнительно 6-бензила- минопурин в количестве 0,5-1,5 мг/л, и кинетин, в количестве 0,5/2,0 мг/л; на втором этапе - формирование пазушных побегов - культивирование ведут на среде Соммера без фитогормонов, на третьем этапе - удлинение побегов - культивирование ведут на среде Соммера с уменьшенным вдвое количеством минеральных солей, в которую дополнительно вносят мочевину в количестве 20-50 мг/л,

Таблица 1

Продолжение табл.1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микроклональному размножению ценных пород деревьев, и может применяться в лесном хозяйстве. Целью изобретения является повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том, что в культуру вводят зимние апикальные почки диаметром не менее 3 мм и последующее культивирование осуществляют в три этапа, при этом используют среды Литвей и Соммера со специфическими фитогормонными добавками. 6 табл.

рН 5.6-5,8

Эффективность образования дисков - отношение числа дисков к числу введенных в культуру эксплантатов, выраженное в %.

Примечание: Концентрация кинетина во всех вариантах 1 мг/.л.

Таблица 2

Продолжение табл.2

Таблица 3

Таблица 4

1571064

Примечание,

(онцентрация БАП во всех вариантах 1 мг/л.

Таблица 5