Способ получения концентрата глюкозоизомеразы Советский патент 1990 года по МПК C12N9/92 C12P19/24 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения концентрата глюкозоизомеразы.

Цель изобретения - повышение активности и стабильности целевого продукта,

Способ получения глюкозоизомеразы осуществляют следующим образом.

Из продуцирующих микроорганизмов Streptoj.yces rubiginosis ATCC 21175 геизисом бактериальных клеток получают бесклеточный экстракт., подвергают . его ультрафильтрации на мембране с проницаемостью на уровне 100000 даль- тон., получают концентрат с активностью глюкозоизомеразы от 200 о .800 ИГЕ/мл.

Значение рН раствора устанавливают Б пределах 5, 7-8, предпочтительно рН 7.

Охлаждают раствор до 16°С или ниже.

Добавляют к раствору сульфат аммония и/или магния в кол - от 50 до 170 г/л. Количестве ата зависит от начальной концентрации глю- козоизомеразы, а также от конечной температуры кристаллизации. Предпочтительным является количество добавляемого сульфатаf при котором проис ,ходит кристаллизация только глюкозоизомеразы без осахдения других белгков.

Добавление сульфата предпочтитепь- но проводят постепенно, так что до-

ЈЛ SI У1

СО 4.

ОЭ

ы

бавление всей соли занимает 2-4 ч, Ко желаемый результат может быть получен добавлением всего количества соли одной порцией но в этом случае размер кристаллов изомеразы остается ма- пым.

Раствор охлаждают в течение нескольких часов до температуры, приближающейся к температуре замерзания Конкретного раствора. Температура замерзания при самой низкой испытанной концентрации сульфата примерно +-2°С и при самой высокой концентрации Доставляет +16°С9 охлаждение может быть начато либо с одновременным добавлением сульфата, либо после добавления сульфата6 Путем постепенного Охлаждения достигают эффекта кристаллизация - охлаждение, заключающегося в уиеличении размеров кристаллов и в TOMS что охлаждение уменьшает растворимость э что приводит к увеличению выхода в

Кристаллы глнжозоизомеразы отде- ляют путем осаждения их на дно емкости -фильтрованием или центрифугированием в сепараторах непрерывного действия

Определенную кристаллическую массу Смешивают с сухим углеводом или его концентрированным водным раствором, При этом происходит растворение Яаллов глюкозоизомеразы с получением устойчивого концентрата

При желании кристаллизация может быть повторена и в этом случае кристаллическая масса должна быть растворена в большом количестве воды с температурой 20-30°С.

Количество воды должно быть тако-- аым9 что активность фермента в растворе составляет 500 - 2000 ИГЕ/мл, т,,ев количество воды в 4-10 раз превышает кристаллическую массу.

Полученные концентраты глюкозоизомеразы представляют собой чистые, устойчивые,, удобные в обращении и легкодозируемые препараты Их активность может регулироваться в пределах от 2000 до 5000 ИГЕ/г-препарата.

Концентрат глюкозоизомеразы пред-- ночтительно содержит 30-60 маса% растворимого в воде углевода, 5-17 мас,% глюкозойзомеразы не более 15 мас.% сульфата аммония и/или магния и/или буфера с рН 6-8 и водуэ

Пример 1, Посевную культуру Streptomyces rubiginosis ATCC 21175

Q

5

0

5

0

5

0

ферментируют известным способом в 40- кубовом ферментере. Клеточную массу лизируют, клеточный остаток удаляют фильтрованием через обычные барабанные фильтры с кремнеземом5 получая 12 т содержащего ггкжозопзомерезу фильтрата, Полученный фильтрат под- вергйют ультрафильтрации через ультрафильтр PCI (Patterson - Candy Inc,) с проницаемостью на уровне 100000 даль- тон, получая 3000 кг концентрата глюкозоизомеразы с активностью 960000000 ИГЕ, Прошедший через мембрану фильтрат удаляют,

К полученному концентрату добавляют 120 кг сульфата магния и 300 кг сульфата аммония Для ускорения кристаллизации смесь охдажденот до 10°С. Декантированием отделяют образовавшиеся кристаллы и кристаллизацию повторяют добавлением 411 кг воды, а также 17 кг сульфата магния и 1 кг сульфата аммония. Снова отделяют кристаллы декантированием. Добавлением 452 кг воды кристаллическую массу растворяют и прибавлением 1 М раствора аммиака рН раствора доводят до 6,5, С помощью пластинчатого фильтра раствор отфильтровывают и кристаллизацию повторяют еще раз добавлением 16 кг сульфата магния и 40 кг сульфата аммония.

Получают 90 кг кристаллической массы, содержащей 20 кг фермента, 3,7кг солей, остальное вода, К кристаллической массе прибавляют 45 кг глюкозы и 45 кг фруктозы, а также 20 кг инвертированного сахара, имеющего содержание сухого вещества 70 мас,%, В результате получают 200 кг препарата фермента, имеющего состав, мас.%г вода 29,2, сахар 52 глюкозоизомерз- за 1495, соль сульфата магния и аммония 4, 3 „

Активность глюкозоизомераэы в концентрате 4500 ИГЕ/г.

Пример 2. По методике примера 1 готовят ультрафильтрованный фер- ментат. К 4000 кг его прибавляют 244 кг кристаллического сулыЬата аммо кия., а затем раствор сульфата аммония, содержащего 600 кг соли в 900 л воды. Раствор охлаждают до 13°С и выдерживают при этой температуре 20 ч. Образовавшуюся кристаллическую массу отделяют в сепараторе фирмы Вест- фалиа-Na-. Кристаллы растворяют в ч воде и полученный раствор отфильтровы51575946

вают с получением 20СЮ л фильтрата. Кристаллизацию повторяют использова- нием 122 кг кристаллического сульфата аммония в растворе сульфата аммония, содержащего 300 кг сульфата аммония в 460 л воды. Полученную кристаллическую массу вновь отделяют в сепараторе, К 525 кг кристаллической массы прибавляют такое же количество фруктозы кристаллической, затем полученная масса растворяется с частичной изомеризацией фруктозы в глюкозу. Получают концентрат, содержащий

м

10

мас.%: сахар 50; фермент 11,2; сульфат аммония 3, 5; вода 35,3. Активность глюкозоизомеразы в концентрате составляет 3000 ИГЕ/г.

П р и м е р 3. По методике примера 1 приготавливают 4000 л ультрафильтрованного фермента с активностью 240000000 ИГЕ. 5%-ным раствором NaOH pH доводят до 7,0, температуру устанавливают равной 12 С.

Для кристаллизации глюкозоиэомера- зы в 750 л воды растворяют 500 кг сульфата аммония и полученный раствор прибавляют в течение 2 ч при равноерной скорости прибавления. Полученный раствор охлаждают до -2°С и переешивают 24 ч, В сепараторе Вестфалия a-7 отделяют кристаллы глюкозоизоме- азы. Выход кристаллической массы составляет 290 кг при содержании в ней 23,6 мас.% сухого вещества и активности 2300000000 ИГЕ. К кристаллиеской массе добавляют 30 кг хлорида натрия и 180 кг глюкозы, рН полученного концентрата фермента устанавливат 7,0 добавлением 5%-ного раствора aOH, при этом глюкоза частично изо- еризуется.

Получают 600 кг устойчивого конентрата фермента,содержащего, мас.%: ода 49,7; сахар 30; фермент 12,8; ульфат аммония 2, 5 и хлорид калия . Активность глюкозоизомеразы в конентрате составляет 3400 ИГЕ/г.

Пример 4. По методике примеа 1 получают 4000 л ферментата с акивностью 240000000 ИГЕ. Добавлением %-ного раствора устанавливают рН аствора 7,0, температуру 12 С. Для ристаллизации глюкозоизомеразы в 50 л воды растворяют 500 кг сульфата ммония и полученный- раствор прибавяют в течение 2 ч при равномерной корости подачи. Декантированием от- еляют кристаллы глюкозои омеразы.

15

20

25

30

35

40

45

щ

1 т с в э в 5

це

1 це 0, но су на во ва по на эь ки 97 та вс но це во че

та ко ср ва В пр де пр де пр же

ос ст ни но

50 ее пр ся ма с

55 во пр

че зу

Получают 230 кг кристаллической массы, содержащей 40 мас,% сухих

5

0

5

0

5

0

5

ществ с активностью 2300000000 ИГЕ.

К кристаллической массе добавляют 115 кг глюкозы и 115 кг фруктозы, а также 50 кг инвертированного сахара с содержанием 70 мас.% сухого вещества. Получают. 510 кг концентрата глюко- эоизомеразы с содержанием, мас.%: вода 30; сахар (глюкоза, фруктоза) 52; фермент 15,1; сульфат аммония 2,9.

Активность глюкозоизомеразы в кон- центратг составляет 4500 ИГЕ/г.

Пример 5, По методике примера 1 получают ультрафильтриианный концентрат глюкозоизомеразы. При 25 С к 0,95 л концеятрата изомеразы с активностью 600 ИГЕ/мл, прибавляют 50 г сульфата аммония. На этой стадии не наблюдается образования осадка. Раствор охлаждают 16 ч при 0°С и выдерживают при этой температуре при мягком постоянном помешивании.. Через два дня начинают выпадать кристаллы изомера- кристаллизация продолжается таким образом, что через пять дней 97,5 мас.% изомеразы находятся в кристаллической форме и только 2,5 мас.% все еше в растворенной форме, в маточном растворе. С помощью лабораторной центрифуги кристаллы отделяют от раствора, получая 56 г влажной кристаллической массы.

Как видно из примера, можно выкристаллизовать изомеразу при очень низ- кок концентрации сульфата аммония по сравнению с количествами, рекомендо- ванными литературными источниками. В то же время данный пример является примером кристаллизации только под действием охлаждения. В свете данного примера легко понять, что если осаждение под действием сульфата аммония проводить быстро и после этого сразу же, например через 15 мин, отделять

осадок в центрифуге, изомераза полностью остается в растворе при применении низкой концентрации сульфата аммония, но даже если изомераза осаждается,

ее кристаллизация не наблюдается и преимущества кристаллизации остаются неиспользованными. Кристаллическая масса, приготовленная в соответствии с настоящим примером, может быть растворена точно также, как и в других примерах.

Концентрат глюкозсизомеразы, полу- ченный согласно изобретению, используют для иммобилизации глюкозоизомеазы на материале-носителе ом реакторе.

1575946

В КОЛОНОЧ

щ из кр а ка ла ку вы ны кр ра ма

Формула изобретения

Ч

1 . Способ получения концентрата глюкоз оизомеразы, предусматривающий куль | тивирование продуцирующего глюкозоизо м.-разу микроорганизма Streptomyces rubiginosis АТССЯ21175 на питательной среде до достижения максимальной активности,, отделение биомассы, лизис клеточной массы с получением бесклеточного экстракта, очистку и концент- рирование экстракта, о т л и ч a fora; и и с я тем, что, с целью повышения активности и стабильности целевого продукта, очистку и концентрировав ние экстракта фермента ведут ультра-

фильрацией на мембране с проницаемостью на уровне 100000 дальтон с получением концентрата активностью 200 - 800 ед ИГЕ/мл„ фермент выделяют осаждением водорастворимой солью сульфата магния и/или аммония в количестве 50 - 170 г/л концентрата, смесь охлаждают до температуры от минус 2 до плюс 13 С, способствующей кристаллизации, полученную кристаллическую мас су отделяют декантированием, кристаллы растворяют в воде и перекристалля- зовывают один или несколько раз, к кристаллической массе добавляют угле

о

0

8

2. Способ поп, 1, отличающийся тем, что фермент выделяют из концентрата добавлением вначале кристаллического сульфата аммония, а затем раствора сульфата аммония в качестве осздителя с последующим охлаждением, полученную кристаллическую массу отделяют и перекристаллизо- вывают растворением в воде, полученный раствор фильтруют и добавляют кристаллический сульфат аммония и его раствор, образованную кристаллическую массу отделяют и смешивают с ЛруктоЗОЙ,

3„ Способ по п. 1, отличающийся тем, что фермент вьщеляют из концентрата добавлением сульфата магния, сульфата аммония и охлаждением, полученные кристаллы отделяют декантированием и перекристаллизовы- вагат добавлением воды, сульфата магния и сульфата аммония, рН доводят до : 6,5 добавлением разбавленного аммиака

-.

и перекристаллизацию проводят добавлением сульфата магния и сульфата аммония, а затем к кристаллической массе добавляют глюкозу, фруктозу и воду с образованием целевого продукта.

Приоритет по пунктам и признакам:

25.06.84по пп. 1-3

06.06.85по п, 1

25.06.84 - фермент выделяют осажде

Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения - повышение активности и стабильности целевого продукта. Способ предусматривает проведение кристаллизации глюкозоизомеразы путем добавления к полученному концентрату глюкозоизомеразы, продуцируемой STREPTOMYCES RUBIDINOSIS АТСС 21175 с активностью от 200 до 800 ИГЕ мл, в качестве осадителя водорастворимой соли сульфата магния и/или аммония в количестве от 50 до 170 г/л концентрата, охлаждения смеси до температуры от минус 2 до плюс 13°С для ускорения кристаллизации. Образовавшиеся кристаллы удаляют, и при желании проводят одну или несколько перекристаллизаций добавлением углевода или его концентрированного водного раствора. Получают концентрат глюкозоизомеразы с содержанием углевода от 30 до 60 мас.%, который в дальнейшем может быть использован для иммобилизации глюкозоизомеразы на материале носителе в колоночном реакторе. 2 з.п. ф-лы.

вод в виде кристаллов и/или Концентри- г нием водорастворимой солью сульфата

рованного раствора з количестве, обеспечивающем содержание его в целевом продукте от 30 до 60 мас.%„

магния и/или аммония в количестве 50 170 г/л, а смесь охлаждают от -2 до

мз°с.

нием водорастворимой солью сульфата

магния и/или аммония в количестве 50- 170 г/л, а смесь охлаждают от -2 до

мз°с.