Способ получения трансгенных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики Советский патент 1992 года по МПК C12N15/83 

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в сельском хозяйстве при выращивании табака. Известны методы получения устойчивых к вирусу табачной мозаики (ВТМ) растений табака путем скрещивания чувствительных к ВТМ сортов с устойчивыми видами табака.

Однако при этом имеет место случайное наследование различных генов обоих родителей у потомства и теряются выгодные сочетания генов, влияющих на ценность того или иного сорта. Этого недостатка лишен метод введения в растения генов путем генетической трансформации, поскольку в этом случае в растение передается лишь небольшая последовательность ДНК, включающая один или несколько генов и не нарушающая генетического баланса растения. Другим важным преимуществом этого метода является возможность введения в растение генов из чужеродных организмов, с которыми невозможно осуществить половое скрещивание. И наконец, эти гены можно вводить в растение в составе таких векторов, которые обеспечивают требуемую интенсивность и регуляцию экспрессии вво- димого гена. Описан способ получения трансгенных растений табака, устойчивых к ВТМ, основанный на введении в растительный геном гена, кодирующего белок оболочки данного вируса, подставленного под контроля сильного растительного промотора.

Однако, данный способ не обеспечивает полной защиты от вируса, а дает лишь задержку в появлении симптомов вирусного заболевания при заражении ВТМ, и, кроме того, защитный эффект в этом случае наблюдается лишь при низкой концентрации вируса, осуществляющего заражение.

Описано защитное действие на растения человеческого интерферона в отношении ряда вирусов, в том числе и ВТМ.

Однако оно было показано лишь для случая экзогенной обработки интерфероном растений.

(Л

С

ч

00

ю о ю

Цель изобретения - получение транс- генных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики.

Способ предлагает введение гена ре- комбинантного а-интерфероно человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растения NL tabacum с помощью генетической трансформации растений методом листовых дисков, регенерации на селективной среде растений, зкспрессирующих человеческий интерферон,-и определение устойчивости трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.

Пример. Для трансформации растений №. tabacum используют штаммы Agrobacterium tumefaclens С158 RifR, содержащие разоруженную Ti-плазмиду pGV2260, интегрированную с рекомбинант- ной плазмидой pST2Q. Плазмида pST20 представляет собой экспрессионный век тор pST6 со встроенным в экспрессией- ную кассету под контроль промотора 35S вируса мозаики цветной капусты гена ре- комбкнантного «-интерферона человека. Вектор содержит также ген неомицинфос- фотрансферазы 11, обусловливающий устойчивость трансформированных растений к канамицину. Трансформацию растений табака осуществляют методом листовых дисков следующим образом. Бактерии, вы- ращен ные в минимальной среде А (10,5 г/л К2НРСм, 4,5 г/л КН2РО/|, 10 г/л (NH/feSOu, 0.5 г/л цитрат натрия - 2Н20, 0,5% глюкозы), разводят средой RMIMO до плотности 10 кл/мл и погружают в полученную суспензию кусочки листьео табака сорта Сам- сун, выращенного в асептических условиях, на 3 мин. Кусочки листьев промокают фильтровальной бумагой и переносят на среду для органогенеза и инкубируют в светотроне 3 недели. Высшие побеги осторожно вырезают и поме- щают на среду для укоренения и инкубируют еще 3 недели до укоренения побегой.

Укоренившиеся на селективной среде с канамицином растения табака проверяют биохимическими методами на наличие и экспрессию гена интерферона. Присутствие вставки гена интерферона устанавливают методом дот-гибридизации. Тотальную ДИК, выделенную из растений, денатурируют и наносят на нитроцеллюлозный фильтр, после чего проводят иммобилизацию ДНК на фильтре и гибридизацию с 32Р-меченной ДИК гена интерферона. Растения, дающие

гибридизационный сигнал, содержат вставку гена интерферона.

Транскрипцию гана интерферона в растениях определяют методом ноузерн-гибри- дизации.г Тотальную РНК выделяют из трансгенных растений, фракционируют в денатурирующем агарозном геле с фор- мальдегидом, переносят на нитооиеллюлоз- н ы и фильтр и г и бр и д и з у ю т с ;

0 Р-меченной ДНК гена интерферона. О транскрипции гена интерферона судят по появлению зоны гибридизации, соответствующей молекулам РНК с размером 0,95 т.о. В случае контрольных растений табака, не

5 подвергавшихся трансформации, гибридизация с ДНК гена интерферона не наблюдается.

Синтез интерферона втрансгенных рас- - тениях устанавливают с помощью метода

0 иммунофлюоресценции. Используют моно- клональные антитела против лейкоцитарного интерферона человека. Препараты готовят из листьеп, растирая их в ступке и экстрагируют буфером (25 мМ трис-НС

5 рН8,35; 195 мМ глицин). Препараты центрифугируют, 5 мин при 12000 об/мин, к супер- нанту добавляют этанол до конечной концентрации 20% и пропускают через нитроцеллюлозный фильтр. Проводят реакцию

0 с моноклоиальными антителами против лейкоцитарного интерферона человека, промывают фильтр и осуществляют реакцию с меченными антителами против IgG мыши. Фильтры освещают длинноволновым УФ

5 светом и фотографируютчерез зеленый све- тофильтр, При продукции растениями интерферона наблюдается свечение препаратов под УФ-светом. Растения, продуцирующие интерферон, исследуют на

0 устойчивость в ВТМ.

У растений в возрасте 2-3 мес берут листья и инфицируют их ВТМ втирая суспензию вируса в концентрации 1 мкг/мл в 100 мкл фосфатного буфера рН7,5 стеклян5 ным шпателем в лист. Через 10 мин поверхность листа промывают дистиллированной водой, промокают фильтровальной бумагой и помещают во влажную камеру в темноте в подвешенном состоянии, где инкубируют 30 е сут при 25°С. В качестве контрольных берут растения N. tabacum сорта Самсун, дающих системную инфекцию при заражении ВТМ, и гибрида Терновского, образующих локальные некрозы при инфекции ВТМ.

5 Через 3-е сут на устойчивых к Bf M листьях табака гибрида Терновского образуются четкие локальные некрозы, в то время как на. листьях чувствительного к ВТМ табака сорта Самсун некрозов не наблюдается. Листья трансгениых растений табака сорта Самсун,

экспрессирующие лейкоцитарный интерферон человека, при заражении ВТМ образуют локальные некрозы, похожие на некрозы, возникающие на листьях табака гибрида Терновского. Реакция локаль- ной некротизации у трансгенных растений свидетельствуют об усилении активирусной защиты у данных растений. Введение и экспрессия гена лейкоцитарного интерферона человека в растения N. tabacum, чувствительных к ВТМ, приводит к индукции устойчивости к данному вирусу.

0

Формула изобретения Способ получения трансгенных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики, предусматривающий трансформацию растительного материала, регенерацию его на селективной среде, укоренение и выращивание побегов, отличающийся тем, что, с целью повышения устойчивости растений табака, в качестве растительного материала используют листовые диски табака, а трансформацию проводят с помощью аг- робактерий, несущих плазмиду pGV2260 с геном интерферона человека.

Использование: в сельском хозяйстве при выращивании табака. Сущность изобретения заключается в том, что в ген растений табака вводят ген а -интерферона человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растения N. tabacum с помощью генетической трансформации растений методом листовых дисков плазми- дой pGv 2260, регенерации на селективной среде растений, экспрессирующих человеческий интерферон, и определяют устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.