СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТЕАЗ Российский патент 2006 года по МПК C12N11/08 A61K38/48 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине и ветеринарии при получении инъекционных препаратов иммобилизованных ферментов.

Известно, что водные растворы иммобилизованных ферментных препаратов (ИФП) нестабильны в процессе хранения, поэтому задача получения высокостабильных лекарственных форм ИФП является актуальной. Известны различные способы иммобилизации ферментов на носителях.

Известны способы иммобилизации путем адсорбции фермента на носителях с высокоразвитой поверхностью, а также путем включения фермента в различные гелевые структуры (Иммобилизованные ферменты. Под. ред. И.В.Березина. Т.1, М., Изд-во МГУ, 1976, с.79-140).

Недостатком таких способов является малая прочность связи фермента с носителем, в результате чего фермент в процессе эксплуатации может диффундировать с носителя в раствор.

Известны также способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании фермента с предварительно активированным носителем. Активация носителя необходима для создания на нем функциональных групп, способных взаимодействовать с молекулами фермента.

Известен, например, способ получения иммобилизованного протеолитического комплекса, включающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического комплекса, полученного из Aspergillus oryzae КС. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буфере рН 8,05, а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель-фермент 1:1-3 (А.С. СССР №1041567, кл. С 12 N 11/10, опубл. 15.09.83, Бюл. №34).

Недостатки известного способа - дефицитный и дорогостоящий носитель-ксилоуронид, низкая стабильность целевого продукта, необходимость хранения препарата в условиях холодильника при 0-4°С.

Известен также способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата (ИФП), включающий следующие последовательные стадии (А.С. СССР №730694, кл. С 08 В 37/02, опубл. 30.04.80, Бюл. №16):

1. Активирование носителя-декстрана с мол. массой 20 кДа, в реакции периодатного окисления (степень окисления носителя = 6-48%).

2. Приготовление реакционной смеси: окисленный декстран растворяют в воде до концентрации 50 мг/мл и смешивают с раствором фермента-террилитина в 0,1 М боратном буфере рН 8,5.

3. Иммобилизация фермента: реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при 21°С, затем добавляют 0,1 М раствор боратного буфера, содержащего боргидрид натрия, и перемешивают еще в течение 40 мин.

4. Обессоливание ИФП: путем диализа на холоде (42°С) против дистиллированной воды в течение 48 часов.

5. Отделение избытка несвязавшегося фермента гель-фильтрацией.

6. Лиофильное высушивание.

Получают препарат с удельной активностью 7,4 ПЕ/мг.

Недостатками известного способа являются сложность процесса (длительный процесс активирования носителя, значительные затраты времени, энергетических ресурсов и сырья), низкое качество целевого продукта.

Известен способ получения иммобилизованного протеолитического комплекса, заключающийся в следующем (А.С. СССР №1442548, кл. С 12 N 11/00, опубл. 07.12.88, Бюл. №45). Протосубтилин Г10Х, представляющий собой комплекс бактериальных нейтральных и щелочных протеаз из Вас.subtilis, растворяют в 0,05 М боратном буфере рН 8,4 при 2-4°С в течение 30 мин, а нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 7000 g в течение 30 мин. К полученному супернатанту добавляют 10%-ный водный раствор полиэтиленоксида с мол. массой 600-2000 Да, преимущественно 1500 Да, в соотношении носитель-протосубтилин 1:(7,5-8,5). Смесь фермента с носителем облучают тормозным γ-излучением в дозе 2,3-2,7 Мрад. При этом получают водорастворимый иммобилизованный ферментный препарат с протеолитической активностью 80-120 ПЕ/мл. Препарат представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета, которую хранят при 4-8°С.

Недостатками известного способа являются невысокое качество целевого продукта и низкая стабильность препарата при хранении (через две недели хранения при комнатной температуре препарат теряет 80% активности).

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом - является способ получения иммобилизованного ферментного препарата, включающий иммобилизацию протосубтилина Г3Х на полиэтиленоксиде с мол. массой 1500-4000 Да путем облучения тормозным γ-излучением в дозе 0,9-1,1 Мрад при соотношении фермент-носитель 1:(2-6); при этом перед иммобилизацией реакционную смесь очищают от балластных белков солевым осаждением с помощью фосфата натрия и хлорида кальция, далее добавляют полиэтиленоксид с мол.массой 4000 Да в качестве наполнителя и подвергают лиофильному высушиванию (Патент РФ 2137835, кл. С 12 N 11/08, опубл. 20.09.99, Бюл. №26).

Недостатками известного способа являются низкое качество целевого продукта из-за присутствия в нем значительного количества примесей низкомолекулярных белков, обладающих аллергогенными свойствами, и большого количества хлорида натрия, образующегося в результате взаимодействия хлорида кальция и фосфорнокислого натрия. Присутствие в препарате таких примесей не позволяет использовать его для парэнтерального введения больному, а позволяет применять его с лечебной целью только в качестве наружного препарата.

Технической задачей изобретения является повышение качества целевого продукта, обеспечивающее его применение в ветеринарии и медицине в качестве инъекционного лекарственного средства. Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Готовят реакционную смесь путем растворения протеолитического фермента (ПФ), преимущественно протосубтилина марок Г3Х, или Г10Х, или Г20Х, или культуральной жидкости Bacillus subtilis 0,05М Na-фосфатном буферном растворе (рН 7,2-8,2). Реакционную смесь очищают путем солевого осаждения балластных белков последовательно вводя в раствор хлорид кальция и натрий фосфорнокислый и выдерживая смесь при 8-10°С в течение 16-18 часов, затем последовательно фильтруют через бумажные фильтры (белая лента) и капсульный мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации осуществляют обессоливание, концентрирование и очистку раствора на гемодиализных колонках типа Т-190 (фирма Terumo, Япония) или аналогичных по производительности и ультрафильтрационным характеристикам. В результате ультрафильтрации из раствора протеаз удаляются низкомолекулярные примеси, в частности примеси полисахаридов, которые обладают высокой аллергогенностью и препятствуют его использованию при парэнтеральном, инъекционном введении. Очистку проводят в две стадии, разводя концентрат дистиллированной водой до исходного объема и последующего повторного концентрирования. В полученный высокоочищенный ультрафильтрат протеаз вводят полиэтиленоксид с мол. массой 1500-4000 Да до соотношения фермент-носитель, равного 1:(3-8), и подвергают повторной стерилизующей фильтрации через капсульный мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Далее реакционную смесь фермента с носителем облучают тормозным γ-излучением в дозе 0,5-1,0 Мрад. При этом получают стерильный апирогенный раствор иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеаз с протеолитической активностью 80-120 ПЕ/мл. Препарат представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета, которую хранят при 4-8°С.

Данные по очистке раствора протеаз от полисахаридных примесей представлены в таблице.

Таблица№Кратность концентрированияD_{625Р (оптическая плотность в пермеате)}D_{625С (оптическая плотность в очищенном концентрате)}00 0,412,50,350,427,50,3650,45320,00,360,472-я ступень очистки после разбавления и повторного 20^-ти кратного концентрирования20,00,0150,085

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются следующие: раствор протосубтилина дополнительно очищают сначала путем последовательной фильтрации через бумажный и мембранный фильтры, а затем двухстадийной ультрафильтрацией на гемодиализных колонках, далее в полученный концентрат добавляют полиэтиленоксид до соотношения протосубтилин:носитель, равного 1:(3-8), и подвергают повторной стерилизующей фильтрации на мембранном фильтре, что позволяет получать стерильный апирогенный препарат иммобилизованных протеаз для парэнтерального применения.

Пример 1

1,0 г протосубтилина Г3Х растворяют в 99 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,5 при 10°С в течение 30 минут. Затем в полученный раствор последовательно добавляют 0,625 г хлорида кальция 6-водного и 0,445 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного. В реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, с которым связываются балластные белки. Затем смесь выдерживают при 10°С в течение 18 часов для полной коагуляции осадка и адсорбции балластных белковых примесей. После этого смесь фильтруется последовательно через бумажные фильтры (белая лента) и капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 по ТУ 6-55-221-1532-2000 с диаметром пор 0,2 мкм. Стерильный фильтрат пропускают в рециркуляционном режиме через гемодиализную колонку типа Т-190 (Terumo, Япония) с купрофановыми полупроницаемыми микроволокнами, контролируя степень концентрирования по уменьшению объема концентрата. Пермеат, содержащий балластные пирогенные примеси низкомолекулярных белков, отбрасывают. Процесс ультрафильтрации останавливают при достижении 20-ти кратного концентрирования по объему. В полученный концентрат добавляют полиэтиленоксид до концентрации по массе 5% (соотношение фермент:носитель равно 1:5) и полученный раствор, содержащий высокоочищенные апирогенные протеазы, подвергают повторной стерилизующей фильтрации через капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 и радиационной обработке с целью иммобилизации. Для радиационной иммобилизации смесь разливают в стеклянные флаконы по 10 см³, укупоривают резиновыми пробками и обжимают алюминиевыми колпачками. Флаконы облучают гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад на стационарном гамма-источнике. Выход готового продукта 95%. Полученный препарат контролируют на содержание пирогенных примесей по ГФ XI, вып.2. Пирогенные примеси отсутствуют.

Пример 2

3,0 г протосубтилина Г3Х растворяют в 97 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,5 при 10°С в течение 30 минут. Затем в полученный раствор последовательно добавляют 0,625 г хлорида кальция 6-водного и 0,445 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного. В реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, с которым связываются балластные белки. Затем смесь выдерживают при 8°С в течение 16 часов для полной коагуляции осадка и адсорбции балластных белковых примесей. После этого смесь фильтруется последовательно через бумажные фильтры (белая лента) и капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 по ТУ 6-55-221-1532-2000 с диаметром пор 0,2 мкм. Стерильный фильтрат пропускают в рециркуляционном режиме через гемодиализную колонку типа РВ-190 Tga (Nipro Со., Япония) с купрофановыми полупроницаемыми микроволокнами, контролируя степень концентрирования по уменьшению объема концентрата. Пермеат, содержащий балластные пирогенные примеси низкомолекулярных белков, отбрасывают. Процесс ультрафильтрации останавливают при достижении 10-ти кратного концентрирования по объему. В полученный концентрат добавляют полиэтиленоксид до концентрации по массе 10% (соотношение фермент:носитель равно 1:3,3) и полученный раствор, содержащий высокоочищенные апирогенные протеазы, подвергают повторной стерилизующей фильтрации через капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 и радиационной обработке с целью иммобилизации. Для радиационной иммобилизации смесь разливают в стеклянные флаконы по 10 см³, укупоривают резиновыми пробками и обжимают алюминиевыми колпачками. Флаконы облучают гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад на ускорителе электронов с конвектором, преобразующим поток ускоренных электронов в тормозное гамма-излучение. Выход готового продукта 98%. Полученный препарат контролируют на содержание пирогенных примесей по ГФ XI, вып.2. Пирогенные примеси отсутствуют.

Пример 3

1,5 г протосубтилина Г20Х растворяют в 97 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,5 при 10°С в течение 30 минут. Затем в полученный раствор последовательно добавляют 0,625 г хлорида кальция 6-водного и 0,445 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного. В реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, с которым связываются балластные белки. Затем смесь выдерживают при 8°С в течение 16 часов для полной коагуляции осадка и адсорбции балластных белковых примесей. После этого смесь фильтруется последовательно через бумажные фильтры (белая лента) и капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 по ТУ 6-55-221-1532-2000 с диаметром пор 0,2 мкм. Стерильный фильтрат пропускают в рециркуляционном режиме через гемодиализную колонку типа BLS-512 G (Bellco s.р.а., Италия) с полисульфоновыми полупроницаемыми микроволокнами, контролируя степень концентрирования по уменьшению объема концентрата. Пермеат, содержащий балластные пирогенные примеси низкомолекулярных белков, отбрасывают. Процесс ультрафильтрации останавливают при достижении 12-ти кратного концентрирования по объему. В полученный концентрат добавляют полиэтиленоксид до концентрации по массе 8% (соотношение фермент-носитель равно 1:5,3) и полученный раствор, содержащий высокоочищенные апирогенные протеазы, подвергают повторной стерилизующей фильтрации через капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 и радиационному облучению в дозе 1,0 Мрад на стационарном гамма-источнике. Выход готового продукта 93%. Полученный препарат контролируют на содержание пирогенных примесей по ГФ XI, вып.2. Пирогенные примеси отсутствуют.

Пример 4

10 мл культуральной жидкости Bacillus subtilis с содержанием суммарного белка - 10% смешивают с 90 мл дистиллированной воды или 0,05 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,5 при 10°С в течение 30 минут. Затем в полученную смесь последовательно добавляют 0,625 г хлорида кальция 6-водного и 0,445 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного. В реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, с которым связываются балластные белки. Затем смесь выдерживают при 8°С в течение 16 часов для полной коагуляции осадка и адсорбции балластных белковых примесей. После этого смесь фильтруется последовательно через бумажные фильтры (белая лента) и капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 по ТУ 6-55-221-1532-2000 с диаметром пор 0,2 мкм. Стерильный фильтрат пропускают в рециркуляционном режиме через гемодиализную колонку типа НЕ-1400G (В.Braun, Германия) с гемофановыми полупроницаемыми микроволокнами, контролируя степень концентрирования по уменьшению объема концентрата. Пермеат, содержащий балластные пирогенные примеси низкомолекулярных белков, отбрасывают. Процесс ультрафильтрации останавливают при достижении 20-ти кратного концентрирования по объему. В полученный концентрат добавляют полиэтиленоксид до концентрации по массе 8% (соотношение фермент-носитель равно 1:8) и полученный раствор, содержащий высокоочищенные апирогенные протеазы, подвергают повторной стерилизующей фильтрации через капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 и радиационному облучению в дозе 1,0 Мрад на ускорителе электронов с конвектором, преобразующим поток ускоренных электронов в тормозное гамма-излучение. Выход готового продукта 95%. Полученный препарат контролируют на содержание пирогенных примесей по ГФ XI, вып.2. Пирогенные примеси отсутствуют.

Пример 5

1,0 г протосубтилина Г10Х растворяют в 99 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,5 при 10°С в течение 30 минут. Затем в полученный раствор последовательно добавляют 0,625 г хлорида кальция 6-водного и 0,445 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного. В реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, с которым связываются балластные белки. Затем смесь выдерживают при 10°С в течение 18 часов для полной коагуляции осадка и адсорбции балластных белковых примесей. После этого смесь фильтруется последовательно через бумажные фильтры (белая лента) и капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 по ТУ 6-55-221-1532-2000 с диаметром пор 0,2 мкм. Стерильный фильтрат пропускают в рециркуляционном режиме через гемодиализную колонку типа Clirans Т-SE (Terumo Со., Япония) с купрофановыми полупроницаемыми микроволокнами, контролируя степень концентрирования по уменьшению объема концентрата. Пермеат, содержащий балластные пирогенные примеси низкомолекулярных белков, отбрасывают. Процесс ультрафильтрации останавливают при достижении 20-ти кратного концентрирования по объему. В полученный концентрат добавляют полиэтиленоксид до концентрации по массе 8% (соотношение фермент:носитель равно 1:8) и полученный раствор, содержащий высокоочищенные апирогенные протеазы, подвергают повторной стерилизующей фильтрации через капсульный мембранный фильтр марки КФМ.К-020-020 и радиационному облучению в дозе 0,5 Мрад на стационарном гамма-источнике. Выход готового продукта 95%. Полученный препарат контролируют на содержание пирогенных примесей по ГФ XI, вып.2. Пирогенные примеси отсутствуют.

Использование предлагаемого способа позволит повысить качество целевого продукта, обеспечить возможность его применения для парэнтерального введения, а также упростить и удешевить способ, исключив стадию лиофильного высушивания целевого продукта.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине и ветеринарии при получении инъекционных препаратов иммобилизованных ферментов. Готовят раствор протеолитического фермента, преимущественно протосубтилина марок Г3Х, или Г10Х, или Г20Х в 0,05 М Na-фосфатном буферном растворе с рН 7,2-8,2. Полученный раствор очищают солевым осаждением балластных белков, последовательно вводя хлорид кальция и натрий фосфорнокислый, с последующим выдерживанием смеси при 8-10°С в течение 16-18 часов и фильтрованием выпавшего осадка через бумажный и мембранный фильтры. Полученный фильтрат дополнительно обессоливают, концентрируют и очищают ультрафильтрацией на гемодиализных колонках, при этом очистку проводят в две стадии, разводя концентрат дистиллированной водой до исходного объема и последующего повторного концентрирования. В полученный высокоочищенный ультрафильтрат протеаз вводят полиэтиленоксид с молекулярной массой 1500-4000 Да до соотношения фермент-носитель 1:(3-8). Смесь фермента с носителем подвергают повторной стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр и облучают тормозным γ-излучением в дозе 0,5-1,0 Мрад. Изобретение обеспечивает получение стерильного апирогенного раствора иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеаз с протеолитической активностью 80-120 ПЕ/мл. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз, включающий приготовление реакционной смеси растворением протосубтилина в Na-фосфатном буферном растворе с рН 7,2-8,2, солевое осаждение из полученного раствора балластных белков, очистку реакционной смеси фильтрацией через бумажный фильтр, облучение полученного фильтрата тормозным γ-излучением, введение полиэтиленоксида с молекулярной массой 1500-4000 Да, перемешивание до полного растворения, стерилизующую фильтрацию на мембранном фильтре с размером пор 0,2 мкм, розлив в стерильные флаконы, отличающийся тем, что реакционную смесь очищают дополнительной стерилизующей фильтрацией на мембранном фильтре, а затем двухстадийной ультрафильтрацией на гемодиализных колонках, при этом полиэтиленоксид вводят в полученный ультрафильтрат до соотношения протосубтилин: носитель, равного 1:(3-8), а облучению тормозным γ-излучением подвергают разлитый в стерильные флаконы фильтрат, полученный после стерилизующей фильтрации.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют протосубтилин марок Г ЗХ, Г 10Х, Г 20Х.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протосубтилина используют культуральную жидкость Bacillus subtilis с содержанием суммарного белка, равным 10%.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакционную смесь подвергают облучению тормозным γ-излучением в дозе 0,5-1,0 Мрад.