Способ определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях "иммунокап Советский патент 1987 года по МПК G01N33/559 

1)3

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано япя определения антигенов в различных биологических жидкостях.

Целью изобретения является ускорение времени проведения способа и его упрощение.

Пример 1. Предварительно готовят 10%-ный раствор антисыворотки против иммуноглобулинов А, Ми G. Для этого антисыворотку определенного титра разводят в 1 мл дистиллированной воды. Затем к золю 0,5% агара добавляют полиэтиленгликоль мол.м. 6000 в конечной концентрации 5% для улучшения контрастирования преципитата. В смесь вносят раствор антисыворотки в конечной концентрации 10% от общего объема. Дпя получения исследуемой сыворотки берут венозную кров 4-7 мл в пробирку без антикоагулянта и, после свертывания крови, отделяют сыворотку. Стеклянные капилляры диаметром 1 мм перед использованием выдерживают в смеси Никифорова 30 мин, высушивают и промьшают 1%- ным водным раствором агара. Затем помещают в термостат и при выдерживают 30-40 мин. Цель данной процедуры - создать тонкий слой агарового геля на внутренней поверхности капилляра с тем, чтобы увеличилось сцепление столбика агара с ним.

Смешивание агара с антисывороткой и заливку в капилляры проводят в водяной бане при 50-56 С. Нарезанные капилляры длиной 2,5 см помещают в пластиковые пробирки, куда заливают зопв агара с антисывороткой. Можно использовать капилляры различного диаметра, так как ни диаметр, ни дли на не влияют на конечный результат. После застьшания капилляры осторожно извлекают пинцетом и помещают в пробирку с любым объемом исследуемой сыворотки, при условии, что весь капилляр (его концы) будут находиться ,в ней.

Пробирку помещают в горизонтальном положении в термостат при на 40 ч.

По окончании инкубации считывание результата производят измерением дли ны столбика преципитации с двух концов в капилляре. По имеющимся стандартам с известной концентрацией белка строят калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге, по которой находят концентрацию иммуноглобули-

42

нов в исследуемой биологической жидкости. К каждой партии ка пилляров прилагают соответствующую калибровочную кривую.

Определение концентрации иммуноглобулинов.

Приготовление капилляров против иммуноглобулинов классов М, А, G проводят аналогично вышеописанной

процедуре. Сыворотку крови отсасывают в пластиковую пробирку разового пользования объемом от 0,5 до 1 мл. Три капилляря против IgA, М и G пинцетом помещают в пробирку. Для маркирования капилляров можно использовать любую краску по стеклу, например красную краску для IgG, зеленую для IgM, желтую для IgA. Пробирку с капиллярами помещают в термостат

в горизонтальном положении и инкубируют смесь в течение 40 ч. По окончании инкубации с помощью лупы МБС-9 определяют длину столбика преципитации с каждой стороны капилляра, определяют среднюю величину и по калибровочной кривой находят искомые цифры концентрации иммуноглобулинов.

.Пример 2. Определение концентрации секреторного иммуноглобулина А и сьюороточных IgA, М, G с использованием 2% ПЭГ-бООО в слюне.

Капилляры с антисывороткой против секреторного иммуноглобулина А готовят так же, как в описании предлагаемого способа в примере 1.

У доноров в пробирку собирают 2-4 мл слюны. Центрифугируют в течение 20 мин при 4000 g и t° . Затем надосадок помещают в пластиковые пробирки объемом 0,5-1 мл, туда же вкладьшаются подготовительные капилляры. Проводят инкубацию при в течение 48 ч. Для исключения бактериального роста в слюну добавляют 1-2 капли 0,01% мертиолата.

Снятие результата и вычисление концентрации секреторного IgA проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. В качестве вещества, усиливающего контрастности, преципитата используют декстран Т-20 (мол.м. 20000),.приготовление капилляров и считывание результатов прово,- дят аналогично предлагаемому способу

с использованием ПЭГ-6000.

Метод в сравнении с известным способом прост в исполнении, требует гораздо меньше времени - до 48 ч, по известному способу - 7 дней.

.313

При использовании предлагаемого способа исключается необходимость в специальной дорогостоящей аппаратуре Немаловажным элементом является значительное удешевление единичного определения, которое достигается за счет резкого снижения расхода специфических антисывороток. Точность метода до tlO%, она достигается за счет считывания результатов с обеих концов капилляра и вьшедения среднего арифметического значения.

Хранение капилляров 2-3 мес при . Для предотвращения бактериалы- ного загрязнения добавляют консервант - метриолат 0,01%, 2-3 капли на 100 мл.

Формула изобретения

Способ определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях.

Редактор Г.Волкова

Составитель В.Литовченко

Техред Л.Сердюкова Корректор А. Тряско

Заказ 1967/43 Тираж 777Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д. 4/5

н.«в«в |г г Г .™,в.. 111 гаг л I «в,

Лроизводствеино-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

44

включающий формирование в цилиндриеском капилляре с прозрачными стенками и открытыми концами агарового столбика, содержащего специфическую

сыворотку, погружение капилляра в ис следуемую жидкость и определение концентрации антигенов по величине преципитата, образуемого в агаровых столбиках, отличающийся

тем, что, с цепью ускорения проведения способа и его упрощения, агаровый столбик формируют 0,5%-ным раствором агара, содержащим 10% антисьто- ротки с дополнительным введением

полиэтиленгликоля с мол.м. 6000 или декстрана с мол.м. 20000 до конечной концентрации 2-5%, при этом капилляр полностью погружают в исследуемую биологическую жидкость и инкубируют

в течение 40-48 ч в горизонтальном положении.

Изобретение относится к иммунохимии, предназначено для определения антипенов в разных биологических жидкостях. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. Для этого готовят 10%-ный раствор антисыво ротки против иммуноглобулинов А, М, G. Агаровый столбик формируют 0,5%- ным раствором агара, содержащим 10% антисыворотки с дополнительным вве- . дением полиэтиленгликоля мол.м. 6000 или декстрана мол.м. 20000 до конечной концентрации 2-5%. Смешивают агар с антисывороткой, заливают в капилляры в водяной бане при 50-5б- С. Нарезанные капилляры длиной 2,5 см помещают в пластиковые пробирки, куда заливают золь агара с антисыво- роткой. После застывания капилляры целиком помещают в пробирку с исследуемой сывороткой, а пробирку в термостат при 37 С на 40-48 ч. По оконг чании инкубации считывают результат измеряя длину столбика преципитации с двух концов в капилляре. По стандартам с известной концентрацией белка строят калибровочную крийую, по которой находят концентрацию иммуноглобулинов в исследуемой биологической жидкости. сл tsD 00