Способ определения активной фазы хронических заболеваний печени Советский патент 1993 года по МПК G01N33/559 

у

fe

Изобретение относится к медицине, в частности к гепатологии. Целью изобретения является повышение точности определения активной фазы при хронических заболеваниях печени и ускорение процесса определения. В способе проводят инкубацию исследуемой сыворотки крвви и стандартных растворов с известной концентрацией иммуноглобулина Д в геле в течение 48 ч. Далее пластинку заливает 6-7 мл 1%-го раствора трихлоруксусной кислоты на 2-3 мин, определяют уровень IgD и при уровне IgD выше 0,15 г/л определяют наличие активной фазы хронического заболевания печени, Способ позволяет сократить время исследования на 24 ч и повысить точность за счет стойкого повышения IgD. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки наличия активной фазы при хронических заболеваниях печени.

Целью изобретения является повышение точности и ускорение определения активной фазы при хронических заболеваниях печени.

Способ осуществляют следующим образом.

Производят отбор крови, затем производят приготовление стандартного раствора Igp. оставляют его на 60 мин при комнатной температуре, затем приготавливают набор стандартных растворов от 20 до 90%. приготовляют раствор 0,24 г агарозы СЕВАК в 20 мл вероналового буфера с рН 8.6. ставят в водяную баню при 48-49°С, смешивают с раствором антисыворотки, наносят смесь на стекло размером 85x85 мм.

оставляют на 30-40 мин для застывания геля. В слое гели с помощью шаблона выкра- ивают лунки на расстоянии 16 мм, в них помещают растворы стандарта №1 - №9 и исследуемые пробы в дубликатах. Пластины помещают во влажную камеру на 48 ч при комнатной температуре. Лосле окончания инкубации для улучшения видимости колец преципитации пластину заливают 6-7 мл 1%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) на 2-3 мин, В результате осаждения белков под действием ТХУ четко проступали кольца преципитации. После этого проводили измерение колец преципитации обычным способом. Весь процесс определения IgD составляет 48 ч. В контрольной группе здоровых лиц уровень 1дОсоставил ОДЗ ±0,01 г/л.- Проведенный сопоставительный анализ прототипа и заявляемого способа показал, что общими являются в

00

N

ON О Os

(Л

способе определения gD в крови как показателя активной фазы при хронических заболеваниях печени, включающий в себя растворение содержимого 2-х склянок со стандартом IgD набора IDP фирмы СЕВАК каждую в 1 мл дистиллированной воды, оставляют при комнатной температуре на 60 мин, затем делают разведение растворов стандарты от 90 до 20% растворов, затем из 0,24 г агарозы СЕВАК готовят раствор в 20 мл веронального буфера с рН 8,6 ставят в водяную баню при 48-49° и смешивают с раствором антисыворотки, 14 мл смеси наносят на стекло размером 85x85 мм, оставляют на 30-40 мин для застывания геля, в слое геля выкраивают лунки на расстоянии 16 мм друг от друга и в них помещают растворы стандарта от 100 до 20% и исследуемые пробы сыворотки крови в дубликатах, пластинку помещают во влажную камеру на 48 Ч при комнатной температуре, после чего промывают физиологическим раствором в течение 24 ч, сушат и окрашивают амидочерным. Отличительными признаками является то, что инкубированную пластинку в течение 48 ч заливают 6-7 мл 1% раствора трихлоруксусной кислоты и выдерживают поверхностный слой пластинки в течение 2-3 мин, что способствует быстрому осаждению белка и прекращению реакции диффузии антител в слое агара и четкой визуализации колец преципитации IgD. Способ осуществляется с помощью стандартного набора СЕВАК (ЧССР).

Пример. Кровь в количестве 3-5 мл, взятая у больной смешанным циррозом печени в активной фазе из вены утром натощак, центрифугировалась при 1,5 тыс.оборотов в минуту в течение 5 мин. Сыворотка отсасывалась в количестве 0,5 мл в чистую пробирку. Готовились различные разведения стандарта. Для этого содержимое одной склянки стандарта растворяли в 1 мл дистиллированной воды и оставляли при комнатной температуре в течение 60 мин до полного растворения стандарта. Приготавливалось 7 растворов стандартов: № 1 - исходный раствор (сухой стандарт, разведенный 1 мл дистиллированной воды), № 2 - 0,45 мл исходного раствора № 1 + 0,05 мл физиологического раствора - 90%-и раствор; №3-0,40мл исходного раствора № 1 -0,10мл физиологического раствора - 80%-й раствор; № 4 - 0.35 мл исходного раствора № 1 + 0,15 мл физиологического раствора - 70%-и р-р; Ns 5 - 0,30 мл исходного раствора Ns 1 + 0,20 мл физраствора - 60%-й р-р; № 6 - 0,10 мл исходного раствора № 1 + 0,10 мл физиологического раствора - 50%-й р-р; N° 7 - 0,10 мл раствора Ns 3 + 0.10 мл физиологического раствора - 40%-и р-р.

Приготовление раствора агарозы для

заливки пластины.

Отвешивается 0,24 г агарозы и растворяется в горячем состоянии в 20 мл верона- лового буфера (рН 8,6, ионная сила 0,1), после полного растворения пробирка поме0 щается в баню при 48-49°. В другой сосуд при той же температуре отмеривали пипеткой 15 мл раствора агарозы. Раствор агарозы смешивается с антисывороткой. Для этого содержимое одной склянки антисыво5 ротки растворяется в 3 мл дистиллированной воды. После полного растворения содержимого склянка помещается на 20-30 мин в баню при 48-49°. Затем переносится содержимое одной склянки к отмеренному

0 раствору агарозы и хорошо перемешивается. 14 мл смеси агарозы с антисывороткой наносится на пластину размером 85x85 мм, расположенную строго горизонтально. Слой геля оставался застывать в течение

5 30-40 мин при комнатной температуре, в течение этого времени пластина хранилась во влажной камере. С помощью шаблона в геле выкраивались лунки диаметром 1,75 мм на расстоянии 16 мм. В выкроенные лунки

0 помещались стандартные растворы № 1-7 с помощью микрошприца. Каждое разведение стандарта помещалось в 2 лунки. Таким образом 14 лунок заполнялось стандартными растворами. В следующие 2 лунки поме5 щалась исследуемая сыворотка больного. Лунки заполнялись до самого края вплоть до исчезновения мениска. Пластинка хранилась во влажной камере при комнатной.температуре в течение 48 ч. После этого

0 поверхность геля осторожно заливалась 6-7 мл раствора трихлоруксусной кислоты 1% на 2-3 мин, за это время четко проявлялись кольца преципитации; раствор сливался и измерялись радиусы преципитационных ко5 лец. Строился график, для чего на ось абсцисс наносились показатели квадратов радиусов (средних) преципитационных колец стандартных растворов в мм, на ось ординат - соответствующие концентрации в

0 г/л. Через полученные точки проводилась прямая. Диаметр двух колец преципитации исследуемого больного равнялся 8,2 и 8 мм, средний диаметр 8,1 мм, радиус 4,05 мм, квадрат радиуса 16,4. По оси ординат это

5 соответствует концентрации иммуноглобулина 0 0,21 г/л.

При повторных исследованиях при лечении больных ХЗН уровень IgD нормализуется в более поздние сроки. В таблице показана динамика различных показателей

активности у больных ХЗП в процессе лечения. Из таблицы видно, что уже через 3 недели большинство показателей .активной фазы вернулись к нормальному уровню, в то время как IgD сохраняется повышенным и только через 1 месяц IgD снижается до нормы, что указывает на стойкость повышения IgD при активных процессах и, таким образом, при его снижении можно считать, что активность действительно ликвидирована.

Таким образом, предлагаемый способ определения IgD позволяет: 1 - сократить время исследования на 24 ч, 2 - повысить точность определения активной фазы ХЗП, 15 особенно при ее затухании.

Способ апробирован в условиях терапевтического отделения городской больницы г.Петразаводска.20

Динамика показателей активности ХЗП лечении

0

5

0

Формула изобретения Способ определения активной фазы хронических заболеваний печени, включающий инкубацию исследуемой сыворотки крови и стандартных растворов иммуноглобулина в лунках на пластине с гелем, содержащего специфическую антисыворотку и по диаметру колец препитации определяют уровень иммуноглобулинов в крови больного, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения диагностики, определяют в крови уровень сывороточного иммуноглобулина D и, после инкубации исследуемой сыворотки и стандартных растворов IgD в геле в течение 48 ч пластину обрабатывают 1 %- м раствором трихлоруксусной кислоты в обьеме 6-7 мл в течение 2-3 мин и при уровне IgD выше 0,15 г/л определяют наличие активной фазы хронического заболевания печени.