Способ определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек Советский патент 1983 года по МПК A61B10/00 A61K39/395 

СП

о

О5 О5

00 Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается методики исследования секреторных антител (иммуноглобулинов), которые играют важную роль в зашите организма от инфекции. Иммуноглобулины синтезируются лимфоидными клетками, расположенными в толще слизистых оболочек, и выделяются вместе со слизью на ее поверхнос -ь. Известен способ определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, использующий реакцию ра диально|4 иммунодиффузии (РИД) в агаре по Mancini (i965), которая основана на способности иммуноглобулинов биологических жидкостей образовывать преципитат при соединении с антителами против данного вида иммуноглобулинов 1. При таком способе в ,5-3%-ный агар, приготовленный на ОД М мединал-верона-; ловом буфере (рН 8,6), вносятся антитела против исследуемого вида иммуноглобулинов. В сделанные в агаре с антителами против Ig лунки вносятся эталоны различной концентрации данного вида иммуноглобулинов. В такие же лунки вносится исследуемый материал. В результате взаимодействия иммуноглобулинов, содержащихся в исследуемом материале, и антител, на: ходящихся в агаре, вокруг лунок образу ются ок:руглой формы зоны преципитации. Их диаметр находится в линейной зависимости от концентрации иммуноглобулинов, находящихся в лунках. По графикам, выражающим зависимость диаметра зоны преципитации от к&нцентрации эталонов иммуноглобулинов, определяк)Т концентрацию данного вещества в исследуемом материале. Однако такой способ неприемлем для определения концентрации иммуноглобулинов в секретах верхних дыхательных путей, миндалин, кишечника и т.д., которые забирать в нативном состоянии невозможно из-за незначительного их количества (они покрывают слизистую оболочку в виде тонкого слоя влаги). В срязи с указанным обстоятельством секрет слизистой оболочки забирают путем промыва«ия оболочки буферными растворами хлорида натрия и исследуют иммуноглобулины в смывах. Резуль-. таты такого исследования не дают достаточной точности, так как объемсмываемого материала может колебаться в больщих диапазонах.. Цель изобретения - повыщение точности локального определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, включающему размещение исследуемого м.атериала и материала с лонной концентрацией иммуноглобулинов на поверхности гелеобразной среды, содер жащей антитела против исс51едуемых иммуноглобулинов, измерение зон преципитации по осуществлению реакции иммунодиффузии и определение концентрации данного вещества в исследуемом материале по графикам, выражающим зависимость диаметра зоны приципитации от концентрации эталонов иммуноглобулинов, используют нативный материал, забираемый с помощью стандартных дисков из фильтровальной бума-; ги, а для сравнения используют аналогияные диски, пропитанные эталонными, концентрациями данного видэ антител. Способ осуществляют следующим образом. Для забора материала (секрета слизистых оболочек) применяют стандартные диски из фильтровальной бумаги ГОСТ - 120 26-66, диаметром 7 мм. Материал из слизистых оболочек забирают путем приклады-, вания дисков к поверхности слизистых оболочек до тех пор, пока они не пропитаются секретном (до появления на поверхности диска избытка жидкости). Избыток секрета снимают с диска путем проникновения их: к листу мелованной бумаги. Поскольку диски являются стандартными, каждый из них способен впитать практически один и тот же объем секрета. Пропитанные исследуемым материалом диски высушивают и хранят до момента проведеи исследований в безводной атмосфере, в эксикаторе с помощью влагопоглотителя (пятиокись фосфора и др.). В таком состоянии они сохраняются без потери содержания иммуноглобулинов в течён{1е 3 мес. Исследование концентрации иммуноглобулинов в дисках, пропитанных секретом слизистой оболочки, осуществляют в реакции радиальной иммунодиффузии в агаре. Для этого используют 1,5%-ый агар Дифко, приготовленный .на 0,05 М мединал-вероналовом буфере (рН 8,6). Антисыворотку против соответствующих видов иммуноглобулинов вносят в расплавленный агар при температуре среды, равной 56° С. Koличectво сыворотки , которое необходимо внести в агар, определяют опытным путем. Обычно ее применяют в два раза меньщем количестве, чем при исследовании сыBopoto4Hbix иммуноглобулинов. Смесь агара и антисыворотки выливают в емкость, образованную двумя стеклянными пластинами размером 9x12 см и П-образной рамкой, располагаемой между ними (толщина рамки 1 мм). После остывания агара одну . из пластин снимают путем скольжения по поверхности застьшшей среды.. На освобо-, дившуюсЯ поверхность агара с антись1вороткой против определенного вида иммуногло-i булинов в соответствии с заранее изготовлен ным трафаретом раскладывают диски, npoi;

питанные исследуемым секретом, а также диски, пропитанные эталонными концент- . рациями исследуемых веществ. Стеклянные пластины со смесью агара и антксыворотки и помещенными на них дисками ставят во влажную камеру при t 18-20° С. Оптимальный срок инкубации составляет-5 сут.; После этого пластины выдерживают 6 ч в изотоническом растворе хлорида натрия, красят в течение 2 ч в ном растворе амида черного, приготовленного на 3%-ном,0растворе уксусной кислоты, отмывают в 3 /о-ном растворе уксусной кислоты и измеряют диаметр зон преципитации вокругкаждого из дисков.. i

На масштабной бумаге строят графики,;.г выражающие зависимость диаметра зон преципитации . от концентрации данного (ида антител в диске. По этим графикам определяют концентрацию иммуноглобу-, линбв в исследуемом материале.

Как показали сравнительные исследова-: ния концентрации иммуноглобулинов секре та небных миндалин у здоровых людей и

лиц, частл страдающих ангиной, секрстор Kbie иммуноглобулины миндалин представлены не тол.ько IjA, как это характерно для большинства слизистых оболочек, но ;И Ig G и частично 1{Ме, при этом была,/определена их фактическая концентрация в данном биологическом субстрате. Концентрация иммуноглобулинов у здоровых людей была следующая

,73+ 0,06-10, i,8640,l8-lo мг/л.

у людей , часто болеющих ангиной, концентрация 19 А соответствовала 0,33 0,02 10, а IQ - 0,83±0,06МО.г/л.

Предлагаемый способ исследования мо1 жет быть использован для определения концентрации иммуноглобулинов в секретах,

j которые получать в нативцом состоянии

; известным способом не представляется возможным.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность исследований

20 при локальных определениях кон1 ентраций различных иммуноглобулинов и тем самым повысить их диагностическую ценность.

СПОСОБ ОПРЕД|ЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЕКРЕТЕ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК; включающий размещение исследуемого ма. гериала и материала с эталонной концент рацией иммуноглобулинов на поверхности гелеобразной среды, coAtepKameft антитела против исследуемых иммуноглобулинов, измерение зон преципитации по осуществлению реакции иммунодиффузии и Определение концентрации данного вещества в исследуемом материале по графикам, выражающим зависимость диаметра зоны преципитаций от концентрации эталонов иммуноглобулинов, отличающийс} тем, что, с целью повышения точности локального определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, используют нативный материал, забираемый с помощью стандартных дисков из фильтровальной бумаги, а для сравнения используют аналогичные диски, пропитанные эталонными концентрациями данного вида антител.