Способ оценки биологической активности органических соединений в водных растворах Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к разделу биохимических исследований, направленных на изучение и вьшвление механизма биологичес кой активности компонентов биожидкостей и природных водо

Цель изобретения - упрощение способа при одновременном повьшении его чувствительности„

Способ осуществляется следующим образомо

Берут 30-35 мкл 0,5%-ного раствора крахмала.и добавляют мкг 2,55 РНКо Объем пробы доводят до 600 мкл 5 мМ натрийкарбонатным буфером, рН 7,2 Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, затем добавляют 1/10 объема 15%-ной хлорной кислоты Пробы центрифугиру- ЮТ при 4000 об/мин в течение 15 мин

Отобрав 500 мкл супернатанта, добав- ляют к нему 50 мкл 0,01 -Но раствора 1 + KI, после чего измеряют экстинк- цию при 520 нм на спектрофотометре,, Расчет активности проводят по разности поглощения образца без добавления 2,5 БРНКив присутствии2,5 8РНК..Так оценивают исходную активность 2,5 S РНКо При определении биологической активности компонентов природных вод и биологических жидкостей изучаемый объект вносят в количестве 1-100 мкл (1-100 мкг) в описанную пробу перед ее инкубацией и термостатированием. После определения активности опытного образца инкубационной смеси ее сравнивают с исходной активностью 2,5 S РЖо По полученным результатам устанавливают уровень биологической активности о

ts5

О

О5

Пример 1с Изучение низкомо- лгекулярных компонентов ротовой логической жидкости (РБЖ) человека. Низкомолекулярные компоненты РБЖ были взяты для исследования не случайно. Было показано, что при развитии злокачественных новообразований в РБЖ больных людей появляются специфические , метаболиты с мол. массой 300 - 600 даЛьтон, отсутствующие в РБЖ ус- лОвно здоровых людей. Низкомолекуляр- 1ные компоненты больных ингибируют реакции ветвления oi-глюканов с Наи- : больший эффект наблюдается при ис- ;лользовании 2,5 S РЖ в качестве катализатора этой реакции Влияние низкомолекулярных органических соединений РБЖ на реакцию ветвления cxi-глю- канов показано в табЛо 1о

Определение биоло- .

Пример 2

желтого вещества (ЖБ) природных водо ЖВ представляет собой наиболее растворимую фракцию веществ гуминовой природы, составляющих значительную часть органического вещества природных вод В то же время концентрация ЖВ по отношению к большому количеству других растворенных соединений, например к кoнцeнтpaцшi неорганических солей, черезвычайно мала, поэтому способы и тест- системы для оценки их свойств должны обладать высокой чувствительностью. Влияние препарата ЖВ на активность реакции ветвления «i-глюканов приведено в табл 2с

Как видно из табл„ 2, проверка возможного наличия ветвящей активное- ти в препаратах ЖБ без добавления био катализаторов показала отрицательные результатыо При добавлении ЖВ в инкубационную смесь наблюдается активация реакц;ии, наиболее эффективно проявляющаяся при использовании 2,58 РЖ. Максимальная скорость реакции наблюдалась при 10 мкг ЖВ в пробе. При использовании больших, чем 30 мкг, количеств ЖВ а ктивирующий эффект бьш выражен слабо Таким образом, применение 2,5 S РЖ позволяет не только выявить биологическую активность ЖВ, но и оценить концентрацию этого вещества в сложных мнoгoкo moнeнтныx системах природных вод, при которых они наиболее активныо Кроме того, выявление концентрационного эффекта при оценке биологической активности химических соединений дает информацию о

с Ю 15

20

25

30

35

,)о

45

50

5

сложности механизма действия природных физиологически активных веществ и возможной специфике их действия в естественных условиях

Для оценки биологической активности ЖБ реки и моря данное вещество в различных концентрациях (при разведениях от 1 до 160) вносилось в известную и в предлагаемую тест-системыс Результаты испытаний показали, что при использовании культуры клеток надежный биологический ответ, выражающийся в очаговой деструкции клеточного пласта, удается наблюдать лишь на вторые-третьи сутки при концентрации ЖБ не менее 25-30 мкг/мл, в то время как при использовании предлагаемого способа эффект удается обнаружить в течение 1 ч при концентраидни ЖВ 5-7 мкг/мпо Выявление биологической активности органических соединений с помощью предлагаемого и известного способов приведено в табЛо 3

Из приведенного примера видно,что для выявления биологического эффекта на культуре ткани требуется увеличение концентрации ЖВ в 5 раз и значительное увеличение времени анализа

Предлагаемый способ является простым и надежным, поскольку 2,5 РНК устойчива при длительном хранении в отличие от культуры ткани. I .

Применение способа испытано на различных объектах: экзометаболитах РБЖ (выявлено наличие ингибирующего эффекта экзометаболитов РБЖ людей с наличием злокачественных новообразований) ; ЖБ (выявлена концентрационная зависимость биологической активности препаратов ЖВ природных вод) и других физиологически активных веществ (выявлена различная степень биологической активности органических веществ, содержащихся в образцах воды кислородной зоны и аи-зоны Черного моря, а именно фракций с мол массой .500 дальтон для кислородной зоны и фракций с мол, массой /.300000 дальтон для SH-зоны)„

Формула, изобретения

Способ оценки биологической активности органических соединений в водных растворах путем введения исследуе-- мого раствора в ферментативную тест- систему с последующей регистрагр ей

свойств системы, отлийся тем, что, с целью способа при одновременном его чувствительности, в ка160

1605206

честве т.ест-системы используют препарат 2,58 РЖ, ,а оценку биологической активности проводят по наличию изме. нений скорости ветвления о -глюканов

5 1 . . .

Таблица 1

Изобретение относится к медицине, в частности к разделу биохимических исследований, направленных на изучение и выявление механизма биологической активности компонентов биожидкостей и природных вод. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном повышении его чувствительности. Способ состоит в том, что исследуемую жидкость вводят в тест-систему, содержащую 2,5 S РНК и по наличию изменений скорости ветвления α-глюканов оценивают биологическую активность органических соединений в водных растворах. Наряду с упрощением и повышением чувствительности способ позволяет сохранить время исследования.

Контроль (добавки отсутствуют) РБЖ условно здоровых, людей

5 мкл

10 мкл

РБЖ людей с диагнозом: рак прямой кишки

5 мкл

10 мкл

Добавки ЖВ, мкг

Активность 2,5 S РНК, ед./мгРНК

2000-200 6400-200 11600-210 4000-100 2700-120

2000-100

1800-200 1700-180

-10 -15

1100-200 850-100

I Таблица 2

Эффект добавки, количествораз

О

3,20 5,80 2,00 1,35

Таблица 3