Штамм вируса гепатита А для приготовления диагностических препаратов Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гепатита А (ВГА), пригодного для изготовления антигена, необходимого при изготовлении ди- агно.ртических препаратов

Цель ; изобретения - получение двух термовариантов штамма ВГА.

Для этого в качестве источника антигена используют адаптированный штамм ВГА I очищенный или из клеточного лизата), заражают им перевиваемые клеточные линии PLC(PRF)5 или МК и после трех недель выращивания вируса при в среде МЕН с 2% эмбриональной сывороткой плодов коров клетки разрушают ультразвуком и антиген ВГА после концентрации 6000 по- лизтиленгликолем и очистки хлороформом может быть использован в диагностических препаратах

Штамм МИ-1 и его термовариант . МИ-1,1 получают пассированием в перевиваемой клеточной линии PLC(PKF)5 при 32 и исходного штамма, выделенного в межзпидемический период из фекалий взрослого больного гепатитом A(10P)N в ИФА-10% экстракты фекалий, резко положительная ИФА на IgM антитела к ВГА из сыворотки больного FAi

Штамм обладает всеми признаками и характеристиками ВГА и хранится в Государственной Коллекции Вирусов

Од

О

о:

СП

00 00

лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им, Д.ИоИвановского АМН СССР (кодовый номер ГКВ-801). Штамм охарактеризован по следующим свойствам: вирусологическим, морфологическим, физико-димическим, серологическим и молекулярнобиологичес- ким.

При адаптации штамма МИ от больного ГА используют клеточные линии FRhK-4, РАИТ, ЛЭЧ-240, PLC(PRF)5. Стабильной продукции ВГА данного штамма (МИ-1 и его термовариант МИ-1,1) удается добиться в клеточной линии PLC(PRF)5 (геп токарцино- ма человека) при 32 и 37°С (табл.О Содержание инфекционного материала штамма МИ-1 в культуре на четвертом пассаже составляет ИЕ/мл, на пятом пассаже 1Q® ИЕ/мл, на шестом пассаже 1 О ИЕ/мл.

Физико-химические свойства. При скоростном ультрацентрифугировании в 10-30%-ном сахарозном градиенте у штамма МИ-1 и его термоварианте МИ-1,1 отмечают 2 пика антигенного материала (ИФА):1-й (8-15 фракции) быстрее седиментирующий, соответствует полноценным вирусньм частицам (150S) и 2-ой (16-18 фракции) - дефектным вирусным частицам без нуклеиновых кислот - 908(12),

В CsCl градиенте плавучая плотность полноценного вируса соответствует плотности р 1,33 г/см-.

Морфологические признаки. При негативном контрастировании диаметр очшценных вирусных частиц рекомендуемого штамма колеблется в пределах 27-28 нм. Частицы построены по типу кубической симметрии, имеют сходство с мелкими РНК-содержащими вирусами и не отличаются от прототи ного зарубежного штамма МВВ 11/5, Белковый электрофорез. При электрофорезе вирусных белко штамма видны J структурных белка VP-1, VP-2, VP-3.

Изобретение иллюстрируется следущими примерами.

Пример 1, Использование штамма МИ-1 в ИФА для выявления IgM антител к ВГА в сьшоротках больных

ГА,

Схема постановки реакции о Ан- ти- (Ч (антитела к IgM антителам челвека) адсорбируют на подложку 96-лу ночной плашкио Далее в лунки нано

5

0

5

сят исследуемую сыворотку (разведение 1:1000)о IgM антитела человека иммунологически связывают с анти-|Ч, Далее в лунки наносят АГ ВГА, который иммунологически связывается с IgM антител больных ГА Далее в лунки вносят конъюгат (igG антител к ВГА, меченные пероксидазой) Реакция проявляется субстратом ортофени- лендиаминомо

Сравнительный анализ на выявляе- мость IgM к БГА в сыворотках больных ГА с помощью АГ ВГА от рекомендуемого штамма МИ-1 и штамма МВВ 11/5 на 220 положительных сыворотках .(IgM к ВГА) в 92% случаев (202 сьгооротки) показал одинаковый результат. Штаммом МИ-1 выявляют IgM в,213 сыворотках (97%), а прототипным штаммом МВВ 11/5 - 209 сыворотках (95%). Расхождение в результатах анализов составляет 3-5%,

Гибридизационный анализ.

Для доказательства родства штамма МИ-1 к.вирусам гепатита А гибриди- зационным анализом используют 32 Р-кДНК-ВГА из банка последовательностей штамма МВВ 11/5(ФРГ). Все 32 Р-кДНК-ВГА последовательности гибридизуют с вирусной РНК штамма. МИ-1 в зараженных клетках и не гиб- ридизуются с нзгклеиновыми кислотами не зараженных клеток

Гибридизационные данные подтверждают принадлежность к вирусам гепатита А штамма МИ-1. В то же время наличие биологических отличий (спектр размножения штамма МИ-1 в культурах клеток) от известных штаммов предполагает отличие и в первичной последовательности, что и обуславливает уникальность рекомендуемого штамма.

Пример 2. Продукция вируса 45 гепатита -А штамма МИ-1 в перевиваемой клеточной линии PLC(PRF)5,

В опытах по синтезу вирусной РНК (точечная гибридизация) и белков с образованием антигена ВГА (ИФА) вид- 50 но, что максимум синтеза в РНК и образование антигена достигает максимума для штамма МИ-1 к 3-7 дню после заражения, а для известного штамма WR-61 к 7-14 днюо

Урожай штамма с 1 л культурально- | го матраса за 3 недели роста после заражения составляет 1000-2000 доз.

Пример 3, Сравнительная характеристика штаг-ша МИ-1 и его

0

5

0

55

тррмоварианта МИ-1,1 по репродукции в клеточных линиях с известными штаммами из различных регионов мира (табл.2),

При проведении сравнительного анализа продукции ВГА в различных клеточных линиях штамма с известными виден характерный спектр размножения штамма МИ-1 и его термовариан

та МИ-1,1 в клеточных линиях (PLC(PRF)5 и Ж).

По спектру размножения в клеточных линиях штамма МИ-1 и его термо- вариант отличается от известных. Формула изобретения

Штамм вируса гепатита А ГКВ № 801 для приготовления диагностических препаратов о

Изобретение относится к медицинской вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гепатита А (ВГА) (МИ-1 и его термовариант М-1,1). Целью изобретения является повышение технологичности штамма ВГА. Штамм адаптирован к продукции в перевиваемых клеточных линиях PLC/PRF/5 и МК, при 32 и 37°С пригоден для изготовления антигена, необходимого для получения диагностических препаратов, которые могут успешно применяться для лабораторной диагностики больных ГА, изучения иммунитета в серологических реакциях, в эпидемиологической практике и для идентификации вновь выделяемых вирусов гепатита А. Штамм МИ-1 зарегистрирован в Государственной коллекции вирусов ГКВ-801) и отличается от известных штаммов по спектру размножения в культуре клеток. 2 табл.

Адаптация и репродукция штамма МИ в различных клеточных линиях (по АГ ВГА в ЙФА)

Таблица 2

Сравнительная характеристика штамма МИ-1 и его термоварианта МИ-1,1 по продукции АГ ВГА в клеточных линиях с известными штаммами ВГА из различных регионов мира

Таблица