Способ культивирования хрящевых фрагментов Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области клеточной биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике.

Цель изобретения - повышение проли- феративной активности и улучшение диффе- ренцировки клеток.

Пример 1. Подложки из костной ткани животных готовят следующим образом. Отбирают бедренные кости у 10-дневных цыплят и у 4-6-месячных крыс, помещают их в декальцинатор, состоящий из 20%-ного нитрата натрия и муравьиной кислоты в равных частях. После деминерализации бедренных костей у них отсекают эпифизы , удаляют костный мозг, очищают от мышечных волокон, после чего трижды промывают дистиллированной водой (по ; 20 мин), опускают в 96-градусный спирт на 5 ч для обезжиривания. После этого трижды промывают в дистиллированной воде (по 30 мин), два раза в растворе Хенкса с антибиотиками (по 20 мин), после чего переносят в питательную среду 199, содержащую 10%

глюкозы, в этой питательной среде и хранятся костные подложки при -4°С.

Пример 2. Хращевую ткань, получен- ную у 10-ти дневных крысят с головок бедренных костей, коленных суставов, межпозвоночных дисков тщательно отмывают в двух порциях среды 199 с антибиотиками. Осторожно отсекают лезвием бритвы прилежащие мышечные волокна, связки. Хрящ, взятый с головок бедренной кости, рассекают лезвием на четыре части. Межпозвоночные хрящевые диски и хрящевая ткань коленного сустава не рассекается, а высаживается в костное ложе подложек, полученных от 4-месячных крыс, таким образом, чтобы хрящевая ткань плотно прилегала к костному основанию. Подложки с хрящевыми фрагментами укладывают в чашки Петри, где находится питательная среда 199 с добавлением 20%-ной нормальной инактивированной сыворотки крупного рогатого скота. Культивирование проводят при 36°С в атмосфере воздуха С

OS

ю со

добавлением 5% С02 в течение 15 дней со рменой среды каждые 48 ч. В течение пер- |вых двух дней хрящевая ткань сохраняет {свою первоначальную структуру. Через Ьять суток культивирования наблюдается (увеличение числа хондробластических клеток.

:. Через десять суток культивирования наблюдается аппозиционный рост хряща, недифференцированные клетки на поверхности хряща пролиферируют и дифференцируются в молодые хрящевые клетки. Через 15 сут культивирования наблюдается интерстициальный рост хряща, молодые хрящевые клетки делятся, образуя клеточное гнездо, состоящее из двух или (четырех клеток, т.е. хрящевые клетки ,кле- 1точных гнезд представляют собой клоны. |так как они являются потомством одной ис|ходной хрящевой клетки.

I

i Пример 3. Бедренную кость с хря- i щевыми эпифизами выделяют у 18-дневных куриных эмбрионов, отсекают лезвием бритвы прилежащие мыщечные волокна, связки, отмывают в двух порциях среды 199 с антибиотиками и укладывают в декальци- : нированные косточки-подложки 10-дневных цыплят. Культивирование проводят как I описано в примере 1 в течение 15 сут. Мор- ; фологические особенности культивируемой костной ткани определяют на срезах, окрашенных гематоксилинэоаином.| Костная ткань после культивирования сохраняет свою цитоморфологическую характеристи I ку. Остеобласты располагаются на поверх- ности кости и представляют собой крупные j клетки с одиночн 1м ядром, цитоплазма резко базофильна. У эпифизарных пластинок наблюдается интерстициальный рост хря ща.

При культивировании эксплантатов мыщелков нижней челюсти 19-20-дневных за-

-

родышей мышей, содержащие чистый хрящ, на миллипоровых фильтрах в модифицированной среде Игла в течение 10 дней эффективность культивирования по

известному способу довольно низка. Так в течение первых 2 сут ткань хряща сохраняет свою первоначальную структуру. Через пять суток культивирования хондробластиче- ские клетки исчезают и весь хрящ заполняют гипертрофированные хондроциты, а мезенхимальные клетки дифференцируются в остеобласти, которые продуцн руют ос- теоид. По предлагаемо -1у способу, начиная с пятого дня культивирования, наблюдается

увеличение числа хондробластических клеток и к 10-му дню наблюдается аппозиционный рост хряща с пролиферацией и дифференцировкой недифференцированных клеток, а к 15-му дню культивирования

наблюдается интерстициальный рост хряща.

Добавочное влияние на индукцию хонд- рогенеза в культуре клеток может играть морфогенетический белок, а также остеоиндуктивный фактор, содержащийся в деминерализованной кости, играющей роль в остеобразований in vitro.

Использование способа позволяет с высокой эффективностью получить рост клеток

в хрящевых эксплантатах, которые могут быть использованы в медицине и ветеринарии для регенерации суставных хрящей.

35

40

Формула изобретения

Способ культивирования хрящевых фрагментов, включающий выращивание их на подложках в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения пролиферативной активности и улучшения дифференцировки клеток, в качестве подложки используют деминерализованную костную ткань животных.

Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике. Цель изобретения - повышение пролиферативной активности и улучшение дифференцировки клеток. Способ заключается в том, что хрящевые фрагменты культивируют на подложке из деминерализованной кости в жидкой питательной среде при 36°С в атмосфере воздуха с добавлением 5% CO₂ в течение 15 сут со сменой среды. В процессе культивирования через 10 сут наблюдается аппозиционный рост хряща, а через 15 сут культивирования - интерстициальный рост и активное деление молодых клеток.