1 .
(21)4617786/30-13
(22)07.12.88
(46) 23.12.90. Бкш. № 47
(71)Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт Микроб
(72)Е.Г.Булгакова и Ю.А.Попов (53) 577.2 (088.8)
(56) Rubin F.A. Kupleko, Noon K.F., Baron L.S.I. Clinical Microbio.. 1985, 22, № 4, pj 600-605.
Vensatensan M. at al. 8Jth. Annu Meet Allauta, Ga 1-6, Macch, 1987, Washington D.C. 1987.
(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК 1зЕК7-ДНК-ЗОНД ДЛЯ ИЦЕП-РШИСАЦШ ЫТАМ-- MOB ЧУМНОГО МИКРОБА, НЕСУ.ДИХ Ш1АЗМИДУ ПЕСтаЦИНОГЕННОСТИ, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHE- RICHIA COLI КМ6/РЕК7-ПРОДУЦЕНТ ДНК- ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ЧУМ-ГЮГО МИКРОБА, НЕСУЩИХ Ш1АЗМИДУ ПЕС- ТИОДНОГЕННОСТИ
(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Целью изобретения является создание штамма E.coli, содержащего рекомбинантную ппазмидную
|ДНК, несущую фрагмент гена фибрино- лизина - коагулазы чумного микроба и обеспечивающую получение видоспеци- фичного зонда для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазми- ду пестициногенности. ДНК-зонд фрагмент Р, являющийся частью структурного гена фибринолизина - коагулазы чумного микроба, позволяет идентифицировать штаммы чумного микроба, содержащие плазмиду пестициноген- ности. Р, -зонд видоспецифичен, он ,не гибридизуется ни с ДНК близкородственных бактери й - иерсиний, ни с ДНК бакте рий других родов, продуцирующих фибрин оли зим (стафилококки, стрептококки, холерный вибрион). Сконструирована рекомбинантчая плаз- мида рЕК7, содержащая ДНК фрагмент Р - часть структурного гена фибринолизина - коагулазы. Этой плазмидой трансформирован штамм Escbirichia culi К 802 и получен штамм, обеспечивающий синтез зонда для идентификации штаммов чумного микроба. Синтез вставки-зонда осуществляется в процессе репликации рекомбинантной плаз- миды. 3 с.п. ф-лы, 1 табл.
S
Iw
в:
Л
00
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии. Целью изобретения является создание штамма E.COLI, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК, несущую фрагмент гена фибринолизина - коагулазы чумного микроба и обеспечивающую получение видоспецифичного зонда для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности. ДНК-зонд фрагмент Р 1, являющийся частью структурного гена фибринолизина - коагулазы чумного микроба, позволяет идентифицировать штаммы чумного микроба, содержащие плазмиду пестициногенности. Р 1 - зонд видоспецифичен, он не гибридизуется ни с ДНК близкородственных бактерий - иерсиний, ни с ДНК бактерий других родов, продуцирующих фибринолизин (стафилококки, стрептококки, холерный вибрион). Сконструирована рекомбинантная плазмида рЕК 7, содержащая ДНК фрагмент Р 1 - часть структурного гена фибринолизина - коагулазы. Этой плазмидой трансформирован штамм ESCHERICHIA COLI К 802 и получен штамм, обеспечивающий синтез зонда для идентификации штаммов чумного микроба. Синтез вставки-зонда осуществляется в процессе репликации рекомбинантной плазмиды. 1 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, предназначенный в качестве зонда для идентификации мето- .дом гибридизации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности, способ конструирования .рекомбинантной плазмиды - продуцента
ДНК-зонда и штамм бактерий, содержащий рекомбинантную плазмиду - процу-. цент ДНК-зонда.
Ппазмида пестициногенности чумного микроба (pPst), присутствует в большинстве штаммов этого микроорганизма в отличие от других представителей рода, Yersinia. Плазмида несет гены, ответственные за синтез видеоспецифических антигенов: пестицина 1 фибринолизина и коагулазы. Эти особенности pPst предполагают возможность получения на ее основе видоспе Цифического ДНК-зонда для идентификации чумного микроба.
Целью изобретения является созда- рие штамма бактерий Е. coli, содержащего рекомбинантную ДНК, несу- цую фрагмент гена фибринолизина и коагулазы чумного микроба, и обеспе- |чиваю1цую получение видоспецифичес- ого зонда для -идентификации штаммов |Чумного микроба, несущих плазмиду |пестициногенности. Пдазмида рЕК7, несуш,ая фрагмент |Р, являющийся частью гена фибрино- лизина и коагулазы, локализованного на ппазмиде пестициногенности (pPst) и используемый как зонд, состоит из |следую дих элементов: плазмидная ДНК |вектора рАТ153 размером 3,314 т.п.и, IHind III - BamH I - фрагмент pPst, ;содержащий часть структурного,гена фибринолизина и коагулазы размером 900 П.Н., молекулярная масса плаз- :м.иды рЕК7 2,8MD (4,214 т„п.н.), Ыа- ген, обеспечивающий синтез и-лактама зы и устойчивость к ампициллину , :часть tet-гена, обеспечивающего iустойчивость к тетрациклину; уникальные сайты рестрикции Ava I, Pst I, BamH 1, Cla I, Sal I, Hind III,, Bgl II , Kpn I. .
Синтез вставки-зонда осуществля- i ется в процессе репликации рекомби- : нантной плазмиды. Используют .способ конструирования плазмиды, несущей фрагмент Р, закпючаюищйся в том, что плазмиду пестициногенности подвергают совместному гидролизу зндо- нуклеазами рестрикции Hind III и BamH I, продукты гидролиза разделяют в агарозном геле и меньш1чй из двух фрагментов элюируют , плазмидную ДНК pATj33 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции Hind 111 и BamH 1,продукты гидролиза разделяют в агарозном геле и больший из двух фрагментов элюируют, выделенные и очищенные фрагменты соединяют ДНК-лигазой, затем полученной смесью трансформируют клетки Е. coli К802, трансформанты высевают на среду с ампициллином,, отбирают кпоны, чувствительные к тетраци лину и несуоще Hind III - BamH I вставку, идентичную по подвижности
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
Hind III - BamH I - фрагменту pPst (проверяется рестрикцией и электрофорезом) , и из этих клонов выделяют плазмиду, обозначенную рЕК7.
Штамм - продуцент ДНК-зонда для идентификации чумного Микроба получают трансформацией клеток Е. coli К-802 рекомбинантной плазмидной ДНК рЕКУ. Уровень синтеза зонда в I составе плазмиды в сконструирован- I ном штамме составляет 0,8-1 мг на 1 л при плотности культуры 0,4 при ОВбоО.
Штамм Е. coli К-802, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, грамот- рицательные, неспороносные.
Культуральные признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. На 1,5%-ном питательном агаре Дифко колонии шероховатые, матовые, круглые, края колоний волнистые. При выращивании в жидких YT, LB-средах образуют ровную интенсив ную муть.
Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования 37°С, оптимум рН 6,8 - 7,5.
В качестве источника углерода используют углеводы, органические кислоты, спирты.
В качестве источника азота используют минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме), органические соединения (в виде пептона, триптона, аминокислот).
Устойчивость к антибиотикам: проявляют устойчивость к ампициллину (50-100 мкг/мл).
Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК рЕК7 осуществляют следующим образом.
Пример. Конструирование ре комбинантной плазмидной ДНК рЕК7 и получение штамма E.coli К-802 - продуцента PJ-зонда для идентификации штаммов чумного микроба.
А. Вьщеляют плазмидную ДНК pPst из штамма Y.pestis PKR133 (pPst) и вектора рАТ153 из штамма E.coli ДНК (рА153). Клетки бактерий Y.pestis PKR133 (pPst) выращивают в 250 мл бульона LB с аэрацией в течение ночи. Клетки бактерий Е. coli DHI (рАТ153) подращивают 2,5 ч в 250 мл бульона LB и амплифицируют
хлорамфениколом (С | 20 мкг/мл) . ДНК плазмид pPst и рАТ выделяют.
Клетки бактерий осаждают центрифугированием (6000 об/мин, 4°С, 15 мин). Осадок ресуспендируют в 10 мл раствора 1 (50 к,М глюкоза, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА), добавляют лизоцим до С 5 мг/мл и инкубируют 5-10 мин при комнатной температуре. Добавляют 20 мл свежеприготовленного раствора 2 (О 2 и. NaOH, 1% SDS), перемешивают содержимое и 1.нкубируют 10-15 мин при комнатной температуре. Добавляют 15 мл раствора 3 (охлажденный 5 М ацетат натрия, рН 4,8), перемешивают соцержимое и инкубируют во льду 30 мин. Лизат осветляют центрифугированием при 4°С 20 мин при 20000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропа- нола и инкубируют 1-2 ч при 15 с,ДНК осаждают центрифугированием при 12000 об/мин IB течение 30 мин при комнатной температуре. Осадок подсушивают, растворяют в буфере ТЕ, рН 8,0. Дальнейшую очистку ДНК проводят по известной методике равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Разница в выделении pPst по сравнению с рАТ153 заключается только в том, что осадок, полученный из 250 мл ночной культуры Y. pestis PKR133 (pPst), суспендируют в 60 мл раствора 1 , а осадок из 250 мл амплифици- рованной культуры E.coli DHI (рАТ153) - в 10 мл раствора 1, Далее условия лизиса клеток и очистки идентичны для обеих культур.
Концентрацию ДНК плазмид pPst и рАТ153 определяют спектрофотометри- чески при 260 нм. Полученные препара16151816
0,8%-ном агарозном геле. С помощью длинноволнового ультрафиолета визуализируют положение меньшего 5 (900 п,н.) III-BamH I фрагмента (рестриктазы Hind III и BamH I - расщепляют pPst на 2 фрагмента) и электроэлюированием в ванночку извлекают его из геля. Элюат экстрагир 10 ют фечолом, хлороформом и обрабатываю-- эфиром. ДНК плазмиды рАТ153 (10 мкг) подвергают гидролизу рест- риктазами Hind III и BamH I по, методике, описанной выше. Больпмй J5 (3,3 т.п.и,) из двух полученных в ре зультате гидролиза фрагментов извле- кают из геля., электроэлюцией. Элюат очищают от примесей агарозы и смешивают с злюатом, содержащим Hind III- 20-BamH I - фрагмент pPst. ДНК осаждают 96%-ным этанолом, промывают 70%- ным этанолом и подсушивают. Осадок растворяют в буфере для легирования (0,066 М трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ , 5 мИ дитиотрейтола и 1 мМ АТФ) с добавлением ДНК-лигазы фага Т-4 (5 ец,). Легирование проводят 10 - 12 ч при .
В. Анализ рекомбинантных плазмид 30 и получение штамма - продуцента зонда для диагностики штаммов чумного микроба.
25
Получе-нную смесь ДНК плазмид используют для трансформации клеток
40
Е. coli К-802. Трансформированные клетки подращивают 1 ч в бульоне LB и высевают на агаризованную среду LB с ампициллином (20 мкг/мл). Клоны, выросшие на среде с амгшцилли- ном, лизируют и анализируют методом электрофореза в агарозном геле. Отби- Рают клоны, содержащие плазмидную . ты ДНК плазмид pPst и рАТ153 исполь- дд ДНК с несколько меньшей подвижностью, зуют для конструирования плазмиды чем подвижность ДНК рАТ153. Наличие Т У- нужной вставки подтверждают, сравниБ. Клонирование Hind III - BamH I - вая электрофореграммы рестриктов, фрагмента плазмлды пестициногенности полученных при гидролизе эндонуклеа- в векторной плазмиде рАТ153. ДНК плаз-JQ МИДЫ pPst (10 мкг) инкубируют с эндо- нуклеазами рестрикции Hind III (8 ед.) и BamH I (8 ед.) в среднесолевом буфере (50 мИ NaCl, 10 мМ (рН 7,4) трис- HCl, Q мМ MgSO, 1 мМ ДТТ).при 37&С
1 ч. Реакцию останавливают добавлением 0,5 М ЭДТА, рН 7,5 до конечной KOff Ц нтрацйи 10 мМ. Продукты гидролиза разделяют с помощью электрофореза в
55
зами Hind III и BamH I гшазмт-щ pPst, рАТ153 и плазмидной ДНК анализируемого клона, а также наличием сайтов рестрикции на плазмидной ДНК клона для рестриктаз Крп I и Bgl II,имеющимся только на Hind III - BamH I фрагменте pPst. Плазмидняя ДНК, сос оящая из крупного Hind III - i BamH I фрагмента pAT153 и малого фрагмента Hind III - BamH I, обозна
151816
0,8%-ном агарозном геле. С помощью длинноволнового ультрафиолета визуализируют положение меньшего 5 (900 п,н.) III-BamH I фрагмента (рестриктазы Hind III и BamH I - расщепляют pPst на 2 фрагмента) и электроэлюированием в ванночку извлекают его из геля. Элюат экстрагиру- 10 ют фечолом, хлороформом и обрабатываю-- эфиром. ДНК плазмиды рАТ153 (10 мкг) подвергают гидролизу рест- риктазами Hind III и BamH I по, методике, описанной выше. Больпмй J5 (3,3 т.п.и,) из двух полученных в результате гидролиза фрагментов извле- : кают из геля., электроэлюцией. Элюат очищают от примесей агарозы и смешивают с злюатом, содержащим Hind III- 20-BamH I - фрагмент pPst. ДНК осаждают 96%-ным этанолом, промывают 70%- ным этанолом и подсушивают. Осадок растворяют в буфере для легирования (0,066 М трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ , 5 мИ дитиотрейтола и 1 мМ АТФ) с добавлением ДНК-лигазы фага Т-4 (5 ец,). Легирование проводят 10 - 12 ч при .
В. Анализ рекомбинантных плазмид 30 и получение штамма - продуцента зонда для диагностики штаммов чумного микроба.
25
Получе-нную смесь ДНК плазмид используют для трансформации клеток
40
дд
вая электрофореграммы рестриктов, полученных при гидролизе эндонуклеа- JQ
55
зами Hind III и BamH I гшазмт-щ pPst рАТ153 и плазмидной ДНК анализируемого клона, а также наличием сайтов рестрикции на плазмидной ДНК клона для рестриктаз Крп I и Bgl II,имеющимся только на Hind III - BamH I фрагменте pPst. Плазмидняя ДНК, сос оящая из крупного Hind III - i BamH I фрагмента pAT153 и малого фрагмента Hind III - BamH I, обознаiieHa pEK7, a клон E. coli K-802, несущий гибридную плазмиду pEK7, отобран как донор данной плазмиды.
Из клеток клона, содержащего плаз- 1{(иду рЕК7, известными методами вы- целяют плазмидную ДНК, рестрикцируют (;е Bgl II - BamH I и ферментами и иьщеляют ДНК-зонд-фрагмент Р . Затем полученный фрагмент с помощью ДНК грансляции метят Р и гибридизиру- нт по известным методикам блоттинг-- 1 ибридизации с хромосомальной ДНК итаммов Y. pestiso Зонд Bgl II - BatnH I 1 ибридизируется только с плазмидной ДНК pPst и не гибридизируется с други |1ш исследованными хромосомными и плаз видными ДНК.
( Зонд также используется для dot- 7ибридизации с колониями различных :итаммов бактерий по известной мето- ;1;ике.
I Результаты гибридизации приведе- Иы в таблице.,
; Изобретение позволяет получить
ДНК-зонд PI, идентифицирующий штаммы чумного .микроба, несущие пла;змиду pPst. Получен штамм-хозяин E.coli с гибридной плазми,цой рЕКУ, удобный 1для наработки и выделения данного
|ДНК-зонда в необходимых количествах. Гибридная плазмцда рЕК7 многокопий- 1ная, обладает удобным селективным kapKepoM - устойчивостью к ампицил- |пину, амплифицируется хлорамфенико-. inoM. Фрагмент плазмиды пестициноген- |ности, предложенный в качестве зонда |пегко вырезается из рЕК7 при совмест |ном гидролизе рестриктазами Bgl II и ВатпН 1, которые делят плазмиду
. |на два фрагмента с различной подвижностью в агарозном геле. Формула изобретения
и BamH I, продукты гидролиза разделяют с помощью электрофореза в агя- розном геле, меньший фрагмент . . Hind III - BamH I эпектрозлюцией выделяют из геля, векторную плазмидную ДНК рАТ153 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции Hind III и BamH I, продукты гидроли- за разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, больший фрагмент Hind III - BamH I вьиеляют из геля, полученные фрагменты соединяют с помощью ДНК-лигазы, после трансформаци этой смесью клеток E.culi отбирают тетрациклин-чувствительные.клоны и из них выделяют плазмир.у рЕК7.
-ч
161518110
Штамм
р..
Гибридизация Наличие I Фибринолиз с Р -зондом I pPst I
Yersinia pest is EV.
Yersinia pestis Yava +
Yersinia pestis Г|46 ersinia pestis 1680
Yersinia pestis PKR 133.
Yersinia pestis PKR 133 (pFra)
Yersinia pestis PKR 133 (pCad)
Yersinia pestis PKR 133 (pPst)+
Yersinia pseudotyberculosis 1(847) - Yersinia pseudotyberculosis 11(837) I
Yersinia pseudotyberculosis 111(824) I Yersinia pseudotyberculosis IV(807) - Yersinia pseudotyberculosis V(810) Yersinia pseudotyberculosis V(810) Yersinia pseudotyberculosis VI(110)
, Yersinia pseudotyberculosis 66
Yersinia pseudotyberculosis
Yersinia pseudotyberculosis 68I
Yersinia pseudotyberculosis 69I .
Yersinia pseudotyberculosis
Yersinia pseudotyberculosis 414 -
Yersinia pseudotyberculosis 414 (oCad)-
Yersinia enterocolitia Yersinia enteruculitia 885I
Yersinia enterosolitia 1367
Yersinia bovicidae 7
Salmonella typhimurium 4-
Salmonella enteritidis 103 Shigella sonnae 18929
Streptococcus viridis 1
Streptococcus pyogenes 654 I +
Staphylococcus aureus 209
Staphylococcus aureus 6537 . +
Staphylucoccus aureus 3256 -f
Vibrio chulerae chulerae 569B +
E. coli Л 925 (pPst)
E. coli 925 .+ +
E. coli Ji925 (pBK322) E. coli/Д 925 (pEK4)- :- .
Гибрид. +
E. coli HB
E. coli 0600 -
