Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, генетической инженерии и может быть использовано для совершенствования схемы идентификации возбудителя чумы, в том числе для тес- тирования штаммов полевочьей разновидности возбудителя чумы, в которых нет плазмиды пестициногенности.
Цель изобретения - создание зонда для идентификации возбудителя чумы и ускорение идентификации чумы.
Для этого была создана рекомбинатная плазмида pRD100, несущая фрагмент ДНК который присутствует во всех штаммах чумных микробов.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pRD100 является источником зонда для
идентификации возбудителя чумы длиной 2826 п.н. и содержит
-EcoRI /EcoRI - фрагмент, являющийся ДНК вектора РИС19, размером 2689 п.н.;
-EcoRI/EcoRI - 140 п.н. фрагмент плазмиды пестициногенности чумного микроба.
Плазмида неконъюгативна. амплифици- руется при добавлении в культуральную среду хлорамфеникола. Синтез и накопление ДНК-зонда происходит в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет репликона вектора pVC19. Штамм-продуцент зонда получают трансформацией клеток E.coli JM10.3 плазмидой pRD 100. Присутствие в штамме рекомбинзнтной плазмиды подтверждается способностью клеток образовывать неокрашенные колоо XI XI о ел о
нии на питательных средах с ампициллином (5б мкг/мл) и индикатором Xgal, а также продуцировать плазмидную ДНК, из которой при гидролизе рестриктазой Eco RI вы- щепляется фрагмент длиной 140 п.н.
Для конструирования рекомбинантной плазмиды ДНК вектора pVC19, гидролизо- ванного рестриктазой EcoRI, легируют с фрагментом ДНК плазмиды пестициногенности чумного микроба. Лигазной смесью трансформируют штамм E.colt JM 103 и отбирают клоны, неспособные гидролизовать индикатор Xgal из-за отсутствия ft- галак- тозидазной активности.
Штамм E.coti - продуцент рекомбинат- ной плазмиды депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR-310 D.
Штамм ВКМ CR-310 D характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Клетки имеют вид грамотрицательных коротких полиморфных палочек размером 1-2 х 0,3-0,5 мкм.
Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на различных питательных средах; на агаре Хоттингера или LB(pH 7,1-7,2) образуют серые гладкие блестящие мутные колонии диаметром 2-3 мм, на жидких средах - равномерную интенсивную муть.
Физиолого-биохимические признаки.
Клетки растут при 4-45° С, оптимум рН среды 6,8-7,5; ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу, галактозу, маннозу, не ферментируют лактозу, нуждаются в пролине, тиамине, ли- зируются кишечными фагами Avir и Т7, штамм устойчив к ампициллину и стрептомицину.
П р и м е р 1. Клонирование фрагмента плазмиды пестициногенности в кишечной палочке в составе плазмидного вектора pVC19.
Плазмиду пестициногенности чумного микроба (pYPI) выделяют из стационарной жидкой культуры штамма Y.pestis 556/106 Otten.
10 мкг плазмидной ДНК гидролизуют в течение 1 ч при 37° С рестриктазой Mspl (30 ед.) в 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,6), 10 мМ MgCIa, 50 мМ NaCI. Полноту гидролиза контролируют электрофорезом 1/20 части реакционной смеси в 5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Реакцию останавливают прогреванием при 100° С в течение 10 мин и ДНК осаждают из 0,3 М ацетата натрия (рН 5,5) этанолом, Осадок растворяют в 100 мкл воды, добавляют 20 мкл 50%-ного глицерина с маркерными
красителями и подвергают электрофорезу в пластине 5%-ного ПААГ для разделения фрагментов ДНК, полученных в результате Mspl - гидролиза плазмиды,
После окрашивания ПААГ бромистым
этидием из геля вырезают фрагмент ДНК длиной 280 п.н. и элюируют его из геля 400 мкл раствора, содержащего 0,5 М ацетат аммония, 0,01 М ацетат магния, 0,1% SDS,
0 1 мМ ЭДТА. После элюации ДНК осаждают дважды этанолом из 0,3 М ацетата натрия {рН 5,5).
Mspl-фрагмент плазмиды pYPI клонируют по EcoRI - сайту вектора pVC19 после
5 заполнения липких концов у вектора и фрагмента с помощью ДНК-полимеразы Кленова в присутствии четырех дезоксинук- леозидтрифосфатов. В результате легирования по тупым концам по краям фрагмента
0 должны появиться два сайта узнавания ре- стриктазы EcoRI, позволяющие вырезать фрагмент из плазмиды.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pRD100 проводят следующим об5 разом.
1 мкг вектора pVC19 гидролизуют рестриктазой EcoRI (5 ед.) в течение 1 ч при 37° С в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис- HCI, (рН 7,6), 10 мМ MgCIa, 150 мМ NaCI.
0 Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты реакционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. После инкубации смесь прогревают при 100° С 5 мин. и ДНК осаждают из 0,3 М ацетата натрия (рН 5,5)
5 этанолом,
Для заполнения липких концов, образованных при гидролизе рестриктазами, вектор и фрагмент в эквимолярных количествах смешивают в буфере следующего со0 става; ЮмМ трис-HCI (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 150 мМ NaCI, добавляют дезоксирибонукле- отиды (d ATP, dGTP, dCTP, dTTP) до концентрации 100 мкМ и 80 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1. После 20 мин инкуба5 ции при 15° С реакцию останавливают прогреванием при 100° С в течение 5 мин и ДНК осаждают этанолом из 0,3 М ацетата натрия (рН 5,5).
Легирование вектора и фрагмента про0 водят в 30 мкл буферного раствора (50 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 0,5 мМ АТР, 5 мМ дитиотрептол) с помощью ДНГ-лигазы фага Т4 (30 ед.). После 6 ч инкубации при 15° С реакцию контролируют электрофорезом
5 аликвоты (1/10 ч) в 0,8%-ном агарозном геле.
Лигазной смесью (1/10 ч) трансформируют штамм E.coli. После трансформации культуру высеивают на агаризованную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл индикатора $ -галактозидаз- ной активности Xgal и 240 мкг/мл индуктора / -галактозидазы ИПТГ (изопропил-/3-Д-ти- огалактопиранозид). Через 14-20 ч на чашках вырастают колонии трансформантов. Рекомбинантные клоны отбирают по отсутствию (3 -галактозидазной активности, поскольку у них нарушается способность синтезировать Д-галактозидазу из-за сдвига рамки считывания фермента при встраивании в векторную плазмиду фрагмента ДНК длиной 280 п..о.
Из клеток рекомбинантных клонов была выделена плазмидная ДНК. Анализ плаз- мидных ДНК осуществляют с помощью ре- стриктаз Mspl и EcoRI. Для этого по 1 мкг плазмид разных клонов гидролизуют ре- стриктазами, как описано выше, после чего подвергают гидролизат электрофорезу в 5%-ном ПААГ. Все рекомбинантные клоны содержат фрагмент 280 п.п., который , помимо двух EcoRI-сайтов на концах фрагмента, имеет дополнительный EcoRi-сайт, расщепляющий его на два равных фрагмента.
После гидролиза рекомбинантной плаз- миды рестриктазой и релегирования гидро- лизата получают рекомбинантную плазмиду pRD100 Гидролиз, релегирова- ние и анализ рекомбинантных клонов проводят как описано выше.
Секвенирование рекомбинантной плаз- миды pRD100 модифицированным методом Максама и Гилберта показывает, что она содержит фрагмент ДНК длиной 140 п.о., в структуре которого имеется последовательность, содержащая открытую рамку считывания 35 кодонов неизвестного белка, кодируемого плазмидой пестициногенно- сти чумного микроба.
П р и м е р 2. Использование рекомбинантной плазмиды pRD100 в качестве источ- ника ДНК-зонда для идентификации чумного микроба.,
Штамм-продуцент рекомбинантной i плазмиды pRD100 получают трансформацией плазмидной штамма E.coli JM 103 по методу Кохена. Из стационарной жидкой культуры продуцента выделяют плазмид- нуюДНК,
Для получения радиоактивного зонда 5-8 мкг плазмиды pRD 100 гидролизуют 1 ч при 37° С рестриктазой EcoRI в 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7.6, 10 мМ MgCl2, 150 мМ NaCL Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты (0,2 мкг) реакционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. К реакционной
смеси добавляют 3 мкг Р d ATP с удельной активностью 3000 ки/Ммоль, 2
мкл 5 мМ d ТТР и 1 мкл (5-7 ед.) фрагмента Кленова ДИК-полимеразы 1. Смесь инкубируют при комнатной температуре 10 мин, добавляют 20 мкл 50%-ного глицерина с 5 красителем бромфеноловым синим и подвергают электрофорезу в пластине 5%-ного ПААГ для отделения фрагмента от вектора и
не включенного в ДНК о32 Р d ATP. Положение фрагмента в геле определяют после
0 авторадиографии в течении 20-40 мин. Меченый фрагмент вырезают из геля и элюиру- ют 0,3 М ацетатом натрия (рН 5,5) в течение 2 ч при 65° С. К элюату добавляют 10 мкг тРНК-носителя и 2,5 объема 96%-ного нола для осаждения ДНК. Осадок растворяют в 100 мкл дистиллированной воды, прогревают при 100° С в течение 10 мин и используют в качестве зонда для гибридизации колоний видов бактерий.
20Клетки разных видов микроорганизмов,
выращенные на агаризованных питательных средах, наносят на нитроцеллюлозный фильтр с помощью стеклянных палочек. Затем фильтр помещают на фильтровальную
25 бумагу, смоченную 0,5 NaOH, на 5-10 мин. Для нейтрализации фильтр помещают на 10 мин на фильтровальную бумагу, пропитанную раствором 0,2 М трис-НС (рН 7,5) и 1 М NaCI. После 5-минутного просушивают на
3® воздухе фильтр погружают на 15 мин в раствор 300 мМ N32HP04 и 50 ЭДТА (рН 6,8). После этого фильтр высушивают при комнатной температуре, а затем прогревают при 80° С в течение 2 ч. Предгибридизацию
35 проводят в течение 1-2 ч в растворе, содержащем 2 х SSC.0,2% SDS, 5 х Denhardt, 100 мкг/мл ДНК из молок лосося (однократный SSC: 150 мМ NaCI, 15 мМ цитрат Na, однократный Denhardt 0,01 % фиколя, 0,01 % бы40 чий сывороточный альбумин, 0,01%
поливинилпирролидон). Из этого раствора фильтр переносят в раствор для гибридизации (4 х SSC, 0,2% SDS, 2 х Denhardt, 100 мкг/мл ДНК лосося), к которому добавляют
Д1 приготовленный, как описано выше, зонд. Гибридизацию проводят при 60° С в течение 2-14 ч, после чего фильтр отмывают 2-3 раза при комнатной температуре, а затем при температуре гибридизации 1 ч, Высу50 шенный при 60° С фильтр авторадиографи- ровали в течение 12-36 ч с использованием усиливающих экранов.
Результаты гибридизации разных видов микроорганизмов с зондом, полученным из
55 плазмиды pRD100, приведены в таблице. Как следует из таблицы, зонд гибридизуется со всеми штаммами чумного микроба, а также с представителями I серотипа Yersinia pseudotuberculosis (полевочья разновидность), К тому же, так как зонд из плазмиды короче, чем в прототипе, скорость гибридизации с ним в 4-5 раз меньше, чем в прототипе рЕК7,
Формула изобретения 1. Рекомбинантная плззмидная ДНК pRD100 - источник зонда для идентификации возбуждения чумы размером 2826, п.н,, содержащая:
-EcoRI/EcoR -фрагмент, представляющий собой ДНК вектора pVC19, размером 2686 п.н;
-EcoRI/-EcoRI - 140 п,н. фрагмент плазмиды пестициногенности чумного микроба;
-системы рестрикции:
-два участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 140 п.н, друг от друга;
-дваучастка расщепления рестриктазы Pvull, один из которых находится на расстоянии 90 п,н. против часовой стрелки от левого EcoRI-сайта, другой - на расстоянии 232 п.н. по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта;
-генетические маркеры: -- ген/ -лакта- мазы, обеспечивающий резистенпность к ампициллину (Арг); N-концевая часть гена
/ -галактозидазы из E.coll, инактивирован- ная в результате встраивания чужеродного фрагмента, обеспечивающая фенотип lac.
2.Способ конструирования рекомби- нантной плазмиды pRD100, заключающийся в том, что вектор pVC19 обрабатывают рестриктазой EcoRI и смешивают с фрагментом длиной 280 п.н., выделенным из плазмиды пестициногенности чумного
микроба с помощью Mspl; вектор и фрагмент обрабатывают ДНК-полимеразой Кленова в присутствии четырех дезоксинук- леозидтрифосфатов и легируют ДНК-лига- зой Т4, рекомбинантными плазмидами
трансформируют штамм E.coli JM103 и отбирают клоны, устойчивые к ампициллину и не обладающие ft -галактозидазной активностью (lac), из которых выделяют реком- бинантную плазмиду, гидролизуют ее
EcoRI, повторно легируют и трансформируют тот же штамм, из ампициллинустойчивых 1ас штаммов выделяют рекомбинантную плазмиду pRD100, содержащую 140 из 280 п.н. Mspl -фрагмента плазмиды пестициногенности чумного микроба.
3.Штамм бактерий Escherlchia coli - продуцент рекомбинантной плазмиды PRD100.
Yersinia pescis
Yersonia pseudocuderculosis (I серотип) r
Yersinia pseudocuberculosis
80
30
Изобретение относится к медицинской микробиологии. Целью изобретения является создание зонда для идентификации возбудителя чумы и ускорения идентификации чумы. Клонирован фрагмент плазмиды пес- тициногенности чумного микроба в кишечной палочке в составе плазмидного вектора pUC19. ДНК-зонд получают из рекомбинан- тной плазмиды pRD100 после гидролиза ре- стриктазой EcoRI и введения радиоактивной метки G PJdATP с помощью ДНК-полиме- разы. Из двадцати двух исследованных видов бактерий с зондом гибридизуются только штаммы Y. pestis, включая полевочью разновидность и штаммы I серотипа Y. pseudotuberculosis. Рекомбинантная плазми- да pRD100 может быть использована в каче- стве источника ДНК-зонда для совершенствования схемы идентификации чумного микроба и представителей I серотипа псевдотуберкулезного микроба. 2 з.п.ф- лы, 1 табл. 00 с
