Рекомбинантная плазмидная ДНК pES78VCS-источник зонда для идентификации холерных вибрионов и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент рекомбинантной плазмидной ДНК pES78VCS Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/68 C12N15/31 

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, генной инженерии и может быть использовано для совершенствования схемы идентификации холерных вибрионов.

Цель изобретения - создание ДНК-зонда для идентификации холерных вибрионов и штамма E.coll - продуцента источника зонда - рекомбинантной плазмиды, содержа-1 щей в своем составе клонированный видоспецифичныйi участок геномной ДНК V.cholerae eltor.

Рекомбинантная плазмида pES78VCS содержит репликон вектора pUC18, no Hind Ill-сайту которого встроен фрагмент ДНК размером 1,74 т.п.н., полученный из хромосомы V.cholerae eltor 9337. Плазмида неконьюгативна, амплифицируется при добав лении в культуральную среду хлорамфени- кола (160-200 мкг/мл). Синтез и накопление ДНК-зонда происходит в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет ре- пликона вектора pUC18.

В результате гидролиза плазмиды pES78VCS эндонуклеазой Hind III от векторной части отщепляется интактный клонированный фрагмент длиной 1,78 т.п.н. Этот фрагмент строго специфичен для холерных вибрионов и может служить в качестве зонда для их идентификации. В пределах этого фрагмента имеются сайты для Hinc II, Xho I и Sph I, расположенные относительно друг друга следующим образом:

00

о

о

00

ВЕКТОР

Hindi Xho

ВЕКТОР

Hind 111 Sphl Sphl

Hindlll

В качестве видоспецифичного зонда для идентификации холерных вибрионов может быть использован не только целый Hind III - Hind III - фрагмент 1,74 т.п.н., но также и составляющие его участки: Hind III - Xho I - 1,34 т.п.н., Xho I - Hind III - 0,4 т.п.н. и Hln II-Xho 1-0,65т.п.н.

Штамм-продуцент зонда получен трансформацией клеток E.col: HB101 плазмидой pES78VCS. Присутствие в штамме рекомби- нантной плэзмиды подтверждается способ- ностью клеток образовывать колонии на агаре с ампициллином (50 мкг/мл), а также продуцировать плазмидную ДНК, из которой при гидролизе Hind III выщепляется фрагмент размером 1,74 т,п.н. Выход плаз- мидной ДНК из клеток продуцента в стационарной фазе роста составляет 2-3 мг/л бульонной культуры. .

Штамм характеризуется следующими

признаками.

Культурально-морфологические и другие признаки.

Клетки в мазках неотличимы от таковых исходного штамма и имеют вид грамотрица- тельных палочек. На плотных средах обра- зует круглые выпуклые гладкие бесцветные полупрозрачные колонии, В жидких средах образует помутнение и осадок. Устойчив к ампициллину (50 мкг/мл).

Биохимические свойства.

Ферментируете образованием кислоты без газа глюкозу (и маннозу, не ферментирует маннит, сахарозу и лактозу, образует декарбоксилазу лизина, не образует декар- боксилазы орнитина.дигидролазы аргини- на, лецитиназы, гемолизинов.

Лизируется кишечными фагами Тз и Ту, не лизируется Я CI и холерными фагами С и эльтор.

По питательным потребностям - ауксот- роф.

Содержит рекоминантную плазмиду pES78VCS, обусловливающую устойчивость к ампициллину.

Штамм E.coli - продуцент рекомбинан- тной плазмиды депонирован во Всесоюзномнаучно-исследовательскомпротивочумном институте Микроб под номером КМ-57.

Способ получения и использования штамма иллюстрируется примерами.

Пример 1. Получение библиотеки фрагментов ДНК V.cholerae, отбор видеоспецифичного фрагмента и его клонирование в составе плазмиднбго вектора pUC18.

5 0

5

0

5

0

5

0

5

Хромосомную ДНК, выделенную из культуры V.cholerae eltor 9337 фенольным методом, гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Hind III в течение 2 ч при 37°С. Состав реакционной смеси: хромосомная ДНК 10 мкл ( 5 мкг); Hind III 60 ед.; 10х буфер для Hind III 10 мкл; Н20 до 100 мкл.

Параллельно в тех же условиях расщепляли Hind III плазмиду pBR322 и обрабатывали щелочной фосфатазой для удаления концевых фосфатов.

К 15 мкл расщепленной хромосомы прибавляли 1 мкл (0,3 мкг) расщепленной плазмиды, 3 мкл 10х буфера для лигирования и 30 ед. ДНК-лигазы. Смесь доводили дистиллированной водой до 30 мкл и инкубировали в течение ночи при 12°С. Реакцию останавливали прогреванием при 60°С в течение 10 мин. Этой смесью трансформировали компетентные клетки E.coli HB101, полученные при помощи обработки 0,1 М CaCl2 при 4°С в течение ночи. После трансформации культуру высевали на агаризованную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°С. Через сутки выросшие колонии с каждой чашки переносили бархатным штампом параллельно на 2 чашки с агаром LB - одну с ампициллином (50 мкг/мл), другую - с тетрациклином (10 мкг/мл) и инкубировали в течение суток при 37°С. Встраивание чужеродной ДНК в плазмиду PBR322 по сайту Hind III приводит к утрате обусловливаемой данной плазмидой устойчивости к тетрациклину,1 устойчивость к ампициллину сохраняется. Поэтому ре- комбинантные клоны отбирали по признаку ApRTets.

Из 12 различных по размерам встроенных фрагментов ДНК вибриона рекомби- нантных плазмид (случайная выборка) с помощью эндонуклеазы Hind III были получены соответствующие фрагменты и испытаны на видоспецифичность в качестве молекулярных зондов. Радиоактивную метку (32Р-АТР или 32Р-СТР..Г. Ташкент; межреспубликанское объединение В/О Изотоп) вводили с помощью ник-трансля- ции.

Гибридизацию проводили на нитроцел- люлозных фильтрах после получения на них отпечатков колоний V.cholerae Т01 и не 01 (150 штаммов), и 12 других видов рода Vibrio (всего 37 штаммов), а также шигелл, сальмонелл, аэромонад, алломонад. псевдомонад и E.coli (всего 25 штаммов) и их соответствующей обработки с использованием модифи- цироваЯного метода Caml g Kourllsky (MAR - 1978. т- vol. 5. - Р.2381). Нитроцеллюлоз- ные фильтры с фиксированной на них ДНК погружали в раствор для предгибридизации

(2XSSC, 0,2% SDS, 5х раствор Денхардта, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося) и инкубировали в течение 2 ч при 68°С, после чего переносили в гибридизационный буфер (4х SSC, 0,2% SDS, 2х раствор Денхардта, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося), в котором предварительно растворяли в меченные 32Р ДНК-зонды, и инкубировали при 68°С в течение 18 ч. По окончании гибридизации фильтры отмывали раствором, содержащим 2х SSC и 0,2% SDS, дважды по 10 мин при комнатной температуре и АО мин при 68°С, высушивали при 80°С в течение 2 ч и авто- радиографировали на рентгеновской пленке в течение 24-48 ч с использованием усиливающих экранов.

Учет результатов гибридизации после проявления радиоавтографов показал, что только один из исследованных фрагментов положительно реагировал со всеми пред- ставителями биологического вида V.cholerae, включая биовары классический и эльтор, серовары Инаба, Огава и Гикошима, измененные формы холерных вибрионов, не поддающиеся типированию сероварос- пецифическими сыворотками, и штаммы не 01 группы, и не гибридизовался с ДНК ни одного из других видов вибрионов и микро- организмов кишечной группы. Этот фрагмент был отобран для дальнейшей работы и переклонирован в составе вектора pUC18.

Гидролиз вектора pUC18 и его лигиро- вание с фрагментом 1,74 т.п.н. проводили так же, как описано выше для вектора pBR322. Лигазной смесью трансформиро- вали штамм E.coll;Jm ЮЗ.После трансформации культуру высевали на агаризованную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампицил- лина, 40 мкг/мл индикатора / -галактози- дазной активности X-gal и-. 240 мкг/мл индикатора /3-галактозидазы ИПТГ(изопро- -D-тиогалактопиранозид); Через сутки на чашках вырастали колонии трансформантов. Рекомбинантные клоны были отобраны по отсутствию /3-галактози- дазной активности, поскольку у них нарушен синтез этого фермента вследствие сдвига рамки его считывания при встраивании в векторную плазмиду фрагмента чужеродной ДНК.

Из клеток рекомбинантных клонов была, выделена плазмидная ДНК, гидролиз которой эндонуклеазной Hind If с последующим электрофорезом в 0,7% агарозе показал, что рекомбинантная плазмидз содержала фрагмент 1,74 т.п.н. с Hind Ill-сайтами на концах. Соответствующая рекомбинантная ллазмида получила название pES78VCS и в дальнейшем была трансформирована в

штамм Fi.coll HR101, в результате чего был получен штамм-продуцент рекомбинантчой ДНК КМ-57.

Пример 2. Использование рекомби- нантной плазмиды pES78VCS в качестве источника ДНК-зондов для идентификации холерных вибрионов и их применение.

Из стационарной жидкой культуры продуцента выделяли плазмидную ДНК. В результате гидролиза плазмиды pES78VCS Hind 111 от векторной части отщепляется ин- тактный клонированный фрагмент длиной 1,74 т.п.н. Совместный гидролиз эндонук- леазами Hind III и Xho1 приводит к образованию двух фрагментов бактериальной ДНК - 1,34 и 0,4 т.п.н. При гидролизе плазмиды Hind li и Xhol можно получить фрагмент ДНК V.cholerae из центральной части вставки размером 0,65 т.п.н. Все три названных фрагмента обладают такой же абсолютной видоспецифичностью по отношению к V.cholerae, как и интактный Hind III - Hind III - фрагмент и могут быть использованы в качестве зондов для идентификации.

Для получения зондов ДНК плазмиды pES78VCS подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами, разделяли фрагменты в 0,7% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием, вырезали из геля нужные фрагменты в УФ-свете и элюировали из геля с помощью прибора для электроэлю- ции.

Колонии идентифицируемых микроорганизмов, выращенные на плотной питательной среде, отпечатывали на нитроцеллюлозных фильтрах, подвергали соответствующей обработке и гидридизова- ли с мечеными зондами. Все процедуры, проводили так же, как описано в примере 1.

В качестве идентифицируемых микроорганизмов были использованы 1316 штаммов V.cholerae 01, 247 штгммов V.cholerae nonOI, 109 V.parahaemolytlcus, 6. V.alglnolyticus, 3 V.mlmlcus, 8 V.metschnikivii, 6 V.fluvlalis. 2 V.splendldus, 7 V.vulnificus, 3 V.pelagius, 1 V.dlazotrophlcus,;, 1 V.campbellll, 3 V.damsela, 1 V.gollizae, 1 V.angulllarum, 1 V.orientalls, 1 V.proteofytlcus, 8 Salmonella spp, 5 Shlgella spp, 14 Aeromonas spp, 1 Allomonas sp., 2 Preudomonas sp, 3 Comamonas sp., 10 E.coli.

Интактный видоспецифичный участок ДНК и его фрагменты гибридизовались со всеми штаммами V.cholerae 01 и не 01 и не гибридизовались ни с одним из штаммов других видов. Результаты идентификации с помощью зондов подтверждены бактериологическими методами.

Таким образом, сконструирован видос-вектора pUC 18 размером 2,6 т.п.о. с сайтами

пецифичный зонд для идентификации хо-рестрикции, характерными для данного веклерных вибрионов и получен штамм Е.coll-тора; EcoRI-HInd 1 1-полилинкер размером

продуцент источника зонда - рекомбинан-54 т.п.о. с Hind Ill-сайтом для «локирования

тной плазмиды pES78VCS.5 фрагмента хромосомы холерного вибриона:

Формула изобретениягенетические маркеры, гены, регуляторные

1. Рекомбинантная плазмидная ДНКпоследовательности: ген Ыа-/ -лактамазы,

pES 78 VCS - источник зонда для идентифи-обеспечивающий устойчивость к ампицилкации холерных вибрионов размером 4,43лину; ген репрессора lac-оперона; М-концет.п.о.. содержащая Hind III - Hind III --фраг-10 вой участок гена /J-галактозидазы.

мент хромосомной ДНК холерного вибрио-2. Штамм бактерий Eschertchla coli KMна размером 1,74 т.п.о. с сайтами57 - продуцент рекомбинантной плазмидрестрикции: Xho I, Hind II и 2 Sph I внутриной ДНК pES78VCS. фрагмента; Hind IM-EcoRI - фрагмент ДНК

Использование; медицинская микробиология. Сущность изобретения: зонд полученклонированием фрагмента хромосомной ДНК холерного вибриона в составе плазмидного вектора р UC 18. Продуцентом рекомбинантной плазмиды pES78VCS является штамм E.coL.i KM-57. ДНК-зонд получают из рекомбинантной плазмиды после ее гидролиза рестрикцион- ной эндонуклеазой Hind III, электрофореза и элюции клонированного фрагмента из геля. В качестве зонда могут быть использованы как целый фрагмент, так и его участки, образующиеся в результате гидролиза Xho I и Hinc III. Радиоактивную метку / а32Р/ АТР вводят в ДНК методом ник-трансляции. Из 24 исследованных видов бактерий с зондом гибридизуются только представители биологического вида Vibrio chobrac. Рекомби- нантная плазмида может служить источником ДНК-зонда и использоваться для совершенствования схемы идентификации холерных вибрионов. со с