Рекомбинантная плазмидная ДНК РЕК 8, кодирующая фибринолизин YeRSINIa реSтIS, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент фибринолизина YeRSINIa реSтIS Советский патент 1992 года по МПК C12N15/12 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинаНтную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез фибринолизина чумного микроба, способ конструирований рекомбинантной ДНК и штамм бактерий кишечной палочки - продуцент фибринолизина.

Подавляющее большинство штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах СССР и за рубежом, обладает фибринолитической активностью. Предполагаемая видоспецифическая природа белка, обеспечивающего это свойств, открывает возможность разработки новых лабораторных диагностических препаратов с использованием очищенного фибринолизина чумного микроба.

Целью изобретения является конструирование речомбинантной ДНК, кодирующей синтез фибринолизина Y. pestls и получение штамма-продуцента фибринолизина.

Рекомбинантйую плазмидную ДНК рЕ)8 конструируют следующим образом.

Фрагмент плазмиды пестициногенно- стм чумного микроба pPst размером 1,45 т.п.н. (Hind 111-Sma1), детерминирующий фибринолизии, встраивают в векторную ДНК pBR322 по сайтам рестрикции Hind 111-EcoRV (полученная плазмида обозначена рЕК4). Из плазмиды рЕК4 вырезают фрагмент EcoR1-Pst1 (4,9 т.п.н.), включающий геи фибринолизина, а из векторной ДНК pLC24 - EcoRl-Pst1 (1,3 т.п.н.) фрагмент, содержащий PL промотор.

Фрагменты лигируют и ДНК полученной гибридной плазмиды (рЕК8) трансформируют клетки Е. соИК802,

В состав плазмиды рЕК8 входят гены: ген Ыа, обеспечивающий синтезД-лактама- зы (устойчивость к ампициллину), ген fib, обеспечивающий синтез фибринолизина. Плазмида содержит по одному участку расщепления эндонуклеазами Kpnl, Bg)11, EcoRt, Pst1, Hindi 11, 2 участка расщепления эндонуклеаэой BamH1

СЛ

ежвг

а

«т

ю о о

Штамм продуцент фибринолизина получают трансфекцией клеток E.coll K802 фагом A C1857S :Cm и последующей трансформацией лизогенных клеток рекомбинан- тмой плазмидной рЕК8.

Штамм Escherlchla coll К802рЁК8 Ac1857S :Cm характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, грамотри- цательные, неспороносные.

Культуральные признаки: клетки хоро- шо растут на обычно используемых питательных средах. На 1,5% питательном агаре Дифко колонии серовато-белые, блестящие, круглые. При выращиёэнии на жидких YT, LB средах образует ровную муть.

Физиолого-биохимичеекие признаки:

оптимальная температура культивирования 28°С, оптимум рН 6,8-7,5. Увеличение синтеза фибринолизинй происходит при повышении температуры культивирования до 42-44°С с последующей инкубацией при 37°С.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, органические кислоты, спирты.

Источником азбта могут служить минеральные соли (в аммонийной или нитратной формы), органические соединения (в виде пептона, триптона, аминокислот).

Устойчивость к антибиотикам; проявляют устойчивость к ампициллину (50-100 мкг/мл), хлорамфениколу (50-100 мкг/мл).

Пример 1. А, Выделение ДНК плаэ- мйдырРз: из штамма Y.pestisPKRI33 (pPst) иДНКйеКТбрЯрВР322изштамма E.colIDH 1 (pBR 322).

Клетки бактерий Y. pestls PKR133 (pPst) выращивают в 250 мл бульона LB с аэрацией в течение ночи. Клетки бактерий E.coll DH1 (pBR322) выращивают 2,5 ч в 250 мл бульона LB и проводят амплификацию плазмидной ДНК добавлением хлорамфеникола (Ck 20 мкг/мл) в середине экспоненциальной фазы роста. ДНК плазмид pPst и pBR322 выделяют методом Blrnbolm Н,, Doly J., 1979. Клетки бактерий осаждают центрифугированием (6000 об/мин 4°С 15 мин). Осадок ресуспендируют в 10 мл раствора 1 (50 мМ глюкоза, 25 мМ трис HCI рН 8,0 10 мМ ЭДТА) добавляют лизоцим до Ck 5 мг/мл и инкубируют 5-10 минут при комнатной температуре, Добавляют 20 мл свежеприготовленного раствора II (0,2 h NaOH, 1% SDS), перемешивают содержимое и инкубируют 10-15 мин при комнатной температуре. Добавляют 15 мл раствора III (охлажденный 5 М ацетат натрия, рН 4,8),

перемешивают содержимое и инкубируют во льду 30 мин. Лизат осветляют центрифугированием при 4°С 20 мин при 2000 об/мин. К нэдосадочной жидкости добавлягот 0,6 объема изопропанола и инкубируют 1-2 ч при 15°С. ДНК осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 мин, при комнатной температуре, Осадок подсушивают, растворяют в буфере ТЕ, рН 8,0. Дальнейшую очистку ДНК проводят по известной методике равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием,

Концентрацию ДНК плазмид определяют спектрофотометрически.

Б. Конструирование гибридной плазми- ды рЕК4,

ДНКплазмидырРз1:(10мкг)инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Hindi 11 (8 ед)

и Sma1 (8 ед) в буфере (20 мМ KCI, 10 мМ трис-HCI, рН 8,0,10 мМ NgCIa, 1 мМ дитиот- рейтола) при 37°С 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 0,5 М ЭДТА, рН 7,5 до конечной концентрации 10 мМ, Продукты

гидролиза разделяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. С помощью длинноволнового ультрафиолетового света визуализируют положение меньшего (1,45 т.п.н.) из трех фрагментов и электроэлюированием в ванночку извлекают его из геля. Элюат экстрагируют равным объемом фенола однократно, Водную фазу, отобранную после центрифугирования, при 20°С экстрагируют однократно равным объемом хлороформа. После центрифугирования при 20°С отбирают водную фазу. ДНК плазмиды pBR322 (10 мкг) подвергают гидролизу ре- стриктазами Hindi 11, EcoRV по указанной методике (используют среднеебяйъой буфер: 50 мМ NaCI, 10 мМ (рН 7,4 трис-HCI, 10 мМ MgSOi, 1 мМ дитиотрейтол), Больший (4,2 т.п.н,) из двух полученных фрагментов извлекают из геля электроэлюцией. Элюат экстрагируют равным объемом фенола однократно. Водную фазу, отобранную после центрифугирования, при 20°С экстрагируют однократно равным объемом хлорбфор- ма, После центрифугирования при 20°С отбирают водную фазу. Очищенный ялюат

0 смешивают с элюатом, содержащем Hindi 11-Sma1 фрагмент ДНК pPst. ДНК осаждают 96% этанолом, промывают 70% этанолом и подсушивают, Осадок растворяют в буфере для лигирования (0,066 М

5 трис-HCI, рН 7,5; 5 мМ MgCIa, 5 мМ дити- отрейтола и 1 мМ АТФ) с добавлением ДНК лигазы фага Т-4 (5 ед). Лигирование проводят 10-12 ч при 16°С.

Б, Анализ рекомбинантных плазмид и выделение клона, necyaiero рекомбинэнг- ную плазмиду рЈК4,

Полученную смесь ДНК используют для трансформации клеток Ё. coti K802. Транс- формированные клетки подращивают 1 час а бульоне LB и высевают на агаризироэан- ную среду UB с ампициллином (20 мкг/мл). Клоны, выросшие на среде с ампициллином, тестируют на среде с тетрациклином (20 мкг/мл) и плотной среде с фибрином, лизи- pytof и анализируют методом электрофореза о агарозном геле. Отбирают клоны, не выросшие на среде с тетрациклином, лизи- рующие фибрин и содержащие плазмидную ДНК с меньшей подвижностью, чем подвижность ДНК pBR322, Наличие нужной вставки подтверждают наличием сайтов рестрикции на плазмидной ДНК анализируемого клона для рестриктаз Крп1 и ВдШ, имеющимся только на Hlnd11 l-Sma1 фрагменте ДНК pPst. Плазмидная ДНК, состоящая из крупного Hindi 11-EcoRV фрагмента pBR322 и малого Hindi 111-Sma1 фрагмента pPst, обозначена рЕК4, а клон Е. coll К802, Несущий гибридную плазмиду рЕК4, отобран как донор данной плазмиды,

Г. Конструирование гибридной плазмиды рЕК8.

Из клеток клона Е. coll K802, содержа- щего плазмиру рЕК4, изйестными методами (см. выше этап А) выделяют плазмидную ДНК, регистрируют бе (10 мкг) EcoR1 и Pst1 ферментами в высбКосолёпбм буфере (100 мМ NaCI, 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ MgCIa, 1 мМ дитиотрейтол) при 37°С 1 ч. Продукты гидролиза (2 фрагмента) разделяют и извлекают больший (4,9 т,п.и.) фрагмент как описанй выше, ДНК плазмиды pLC24 (10 мкг), выделенную из штамма Е. coll K802 (pLC24), теми же методами подвергают гидролизу рестриктаззми EcoR1 и Pstt. Отбирают меньший из двух полученных фрагментов (1,3 т.п.н,). Очищенные фрагменты смешивают, осаждают 96% эта- нолом, промывают 70% этанолом и лигиру- ют в условиях, идентичных описанным а этапе Б.

Пример 2. А, Получение штамма Е. coll К802, лизогенногО по фагуАс185757:Ст.

Ночную культуру Е, coll C600 Ac1857S7:Cm, выращенную при 28°С, засевают в бульон LB (1:50), инкубируют с аэрацией 1,4 ч при 28°С, Резко повышают температуру до 42-44°С и аэрируют 25 мин, затем при 37°С подращивают еще 2,5 ч. Культуру центрифугируют при 8000 об/мин 15 мии, осадок суспендируют в 1 /50 объема 0,02 М MgSO-j и лизируют смесью хлороформ (ЭДТА) лизоцим, Обломки кпрток1 осаждают. Супернатант, содержащий фаговые частицы, используют для заражения

Культуру Е. coll K802 (МО9 кл/мл) смешивают с 0,1 мл фаголизата и инкубируют 1 ч при 28°С, полученную смесь разводят бульоном LB в 10 раз и 0,1 мл высевают на агар с хлорамфениколом (25 мкг/мл), инкубируют при 28° 48 ч. Выросшие клоны ис- пользуют для трансформации гибридных плазмид с PL промотором.

Б, Получение штамма Е. coll - продуцента фибринолизина.

Лизиропанную смесь ДНК плазмид используют для трансформации клеток Е. coll К802 A c1857S7, Cm. Трансформированные клетки подращивают 1 ч в бульоне LB при 2 8°С и высевают на авизированную среду с ампициллином (20 мкг/мл) и хлорамфениколом (25 мкг/мл). Продукцию фибринолизина определяют на плотной среде с фибрином. Трансформанты пересевают на плотную среду с фибрином выращивают сутки при 28°С, затем проводят индукцию при 42-44°С 30 мин и инкубируют посевы 1-2 ч при 37°С. Вокруг колоний проявляются зоны просветления, свидетельствующие о том, что клоны содержат плаэмиду с вставкой, содержащей детерминант сийтеза фибринолизина под контролем сильного терморегулируемого промотора PL фага А.

В. Тестирование фибринолитической активности в супернатанте Е coll K802 рЕК8 Ac1857S :Cm.

Отдельную колонию штамма Е. coll K802 pEK8Ac1857S7:Cm засевают в 50 мл бульона LB и инкубируют с аэрацией при 28аС 18-24 ч (ДбОО 0,9). Индукцию синтеза проводят При 42-44°С 30 мин, затем продолжают культивирование с аэрацией при 37°С 5-6 ч. Клетки кишечной палочки осаждают при 10000 об/мин, 4°С 15 мин, Супернатант осторожно сливают и фильтруют через нитро- целлюлозный фильтр (Шляйхер и Шулль диаметр пор 0,22 ft м), 50-100 ,м I суперна- танта наносят на плотную сре/ty с фибрио- ном и инкубируют при 37°С, Через 24 ч на месте нанесения супернатантй образуется зона просвеления. Уровень продукции фибринолизина в оптимальных условиях для роста клеток-продуцентов Е. coll составляет 20-30 мг/л.

Предлагаемое изобретение позволяет выделить фибринолизин чумного микроба в препаративных количествах из среды культивирования, что чнзйителино облегчает этапы очистки фибринолизина Получен штамм-продуцент Е с гибридной плаэ- мидой рЕК8 обесппммрмющии синтез фиб

ринолизина. Гибридная плазмида рЕК8 многокопийная, обладает селективным маркером --устойчивостью к ампициллину. Уровень синтеза фибринолизина находится под контролем сильного терморегулируемого PL промотора фага Я. До настоящего времени в литературе не описано конструирование штамма кишечной палочки - продуцента фибринолизина, секретирующего фибринолизин в среду культивирования.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕК8, кодирующая фибринолизин Yerslnla pestls размером 6,2 т.п.н., содержащая

-Pstl - EcoRi - фрагмент векторной ДНК pLC24 размером 1,3 т.п.н., с PL промотором фага А;

-EcoRI - Hind HI - фрагмент размером 29 т.п.н. и EcoRV - Pstl - фрагмент размером 3,4 т.п.н. вектора pBR322 с Ыа-геном;

-Hlndlll - Smal - фрагмент пяазмиды pPst размером 1,45 т.п.н. с fib-геном;

генетические маркеру, гены и регуля- торные элементы:

-Ыа-ген, обеспечивающий синтез ft -яактамаэы и устойчивость к ампициллину;

-fib-ген, обеспечивающий синтез фибринолизина чумного микроба;

-PL промотор фага А;

-сайты рестрикции:

по одному участку распределения Kpnl, EcoRI, Hlndlll, Smal и два участка расщепления эндонуклеазой Bam HI.

2.Способ конструирования плазмидной ДНК рЕК, кодирующий фибринолизин

Yerslnla pestls, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pPst подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами Hindlll и Smal, выделяют Hlndlll - Smal

фрагмент размером 1,45 т.п.н., ДНК плазмиды pBR322 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами Hlndlll и EcoRV, выделяют Hlndlll - EcoRV фрагмент размером 4,2 т.п.н., затем смесью рекомбинантних молекул трансформируют клетки Escherlchla coll K802, трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК, содержащую Ыа-ген, и fib-ген, затем полученную ДНК гидролизуют эндонуклеазами EcoRI и Pstl, выделяют EcoRI Pstl фрагмент размером 4,2 т.п.н. и соединяют ДНК лигазой с EcoRI - Pstl-фрагментом размером 1,3 т.п.н. плазмиды pLC24, содержащим

PL промотор и Полученным в результате гидролиза ДНК pLC24 эндонуклеаэами EcoRI и Pstl, После трансформации клеток Е. coll К802 Ac1857S7:Cm отбирают клоны, обладающие повышенной способностью продуцировать фибринолизин при повышении температуры до 44°С,

3.Штамм бактерий Escherlchla coll KM-9 - продуцент фибринолизина Yerslnla pestls.

Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Получена рекомбинант- ная плазмидная ДНК рЁК8, кодирующая фибринолиэин Yerslnla pestls, полученной плазмидой трансформируют штамм Escherlchla coll K80pEK8Ac1857 S7:Cm KM 9 (6,2 т.п.н.) с последующим отбором штамма Е. coll КМ-9 - продуцента фибриноли,зина Y. pestis. 3 с.п. ф-лы. С , e