Способ выявления функционирующих капилляров Советский патент 1990 года по МПК A61B10/00 

Изобретёние относ1/1тся к медицине, а именно к нормальной патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и может быть использовано для функциональной характеристики терминального звена микроциркуляторного русла в нормальных и патологических условиях.

Цель изобретения - ускорение и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляют одновременно в смеси, состоящей из 40%-ного раствора фор- мальдегида и абсолютного (100°) этилового спирта в соотношении 1:9, при -20°С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной температуре в течение оставшихся двух суток.

Способ осуществляют следующим образом.

Крупных лабораторных животных (например: кролик, кошка, собака) наркотизируют гексеналом (15-20 мг/кг, внутрибрюшинно). Извлекают исследуемый орган, край или часть которого можно выделить без нарушения его кровоснабжения (например: печень, селезенка, желудочно- кишечный тракт и т.д.). Под необходимый участок органа подкладывают кусочек фольON

О

о

ги. Через 10-20 мин отдыха орган заливают переохлажденным пропанбутанам (в дальнейшем - пропан). Для этого открывают вентиль баллона с пропаном и позволяют ему в количестве 100-150 мл свободно вытекать в сосуд Дьюара, на дно которого предварительно кладут небольшой кусочек сухого льда. Затем пропан охлаждают, погружая его в медном стакане в жидкий азот, Проморозку органов у мелких лабораторных животных, таких как мышь, крыса, морская свинка, хомяк и т.д. (предварительно наркотизированных гексеналом в той же дозировке) осуществляют путем опускания тушки в стакан с переохлажденным пропаном. Таким же способом производится глубокое охлаждение ткани головного мозга (доступ к которой в прижизненных условиях невозможен без нарушения регионарного кровенаполнения) с последующим быстрым вскрытием черепной коробки.

Затем из замороженного органа выдалбливают пластинки ткани толщиной 3-5 мм с помощью долота, охлажденного в сосуде с сухим льдом. Выделенный замороженный блок быстро Переносят в смесь, состоящую из 40%-horo раствора формальдегида и абсолютного (100°) этилового спирта в соотношении 1:9, предварительно охлажденную до -20°С в морозильной камере бытового холодильника. Срок инкубации блоков при данной температуре - 4 ч. После этого сосуд с фиксирующими блоками вынимают из холодильника, и дальнейшая инкубация ткани в формалин-этанольной смеси (ФЭС) осуществляется при комнатной температуре. Спустя 6-8 ч от начала инкубации ФЭС необходимо обновить. Полный период инкубации блоков составляет 48 ч. Необходимо помнить, что обьем инкубирующей жидкости должен постоянно превышать объем всех взятых блоков не менее чем в 20 раз.

После окончания инкубации блоков в ФЭС их сразу же пропитывают парафином в условиях пониженного атмосферного давления (достаточно водоструйного насоса). Процесс парафинизации ткани длится 8- 10 мин. Из парафинизированных блоков на обычном микротоме изготаЕшивают срезы толщиной 20 мкм, для расправления их переносят в дистиллированную воду и приклеивают на предметное стекло с помощью белка, приготовленного по Майеру. Затем препараты высушивают и депарафинизиру- ют (ксилол, абсолютный этиловый спирт и 70°-ный этиловый спирт).

После смачивания срезов дистиллированной водой проводят бензидиновую реакцию по Пикворсу. В начале препараты инкубируют в растворе N° 1 втечение5м ин.

Для его приготовления берут 0,5 г бензиди- на-основание и растворяют в 50,0 мл 96°-но- го этилового спирта. 0,1 г нитропруссида натрия растворяют в 10,0 мл дистиллиро- ванной воды. Оба раствора смешивают и доводят дистиллированной водой до 100,0 мл. Раствор нитропруссида натрия не стоек, поэтому его готовят перед употреблением. Признак порчи этого раствора - появ0 ление зеленовато-голубоватой окраски после прибавления раствора бензидина. В последующем среды быстро споласкивают дистиллированной водой и перекладывают в раствор Ms 2 на 3 мин. Для его приготовле5 ния берут 50,0 мл 96° этилового спирта, куда прибавляют 2,0 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 мл пергидроля. 0,1 г нитропруссида натрия растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды. Оба раствора сме0 шивают и доводят дистиллированной водой до 100.0 мл. После окончания инкубации препараты споласкивают дистиллированной водой не менее 10 мин и высушивают электрическим вентилятором.

5Конечный этап способа состоит из последовательного обезвоживания (в 96°-ном этиловом спирте), просветления (в ксилоле) и заключения препаратов в бальзам. Предпочтительно хранить готовые препараты в

0 темноте, поскольку на свету они со временем выцветают,

Внутрисосудистые эритроциты, обработанные с помощью бензидина, окрашиваются в черный цвет, поэтому

5 функционально-активные капилляры хорошо контрастируют на бесцветном или слегка зеленовато-голубоватом фоне среза.

П р и м е р 1. Белой беспородной крысе - самцу массой под гексенало0 .вым наркозом (15 мг/кг, внутрибрюшинно) произведен срединный нижне-шейный кожный разрез. После выделения проксимального сегмента обеих подключичных артерий отыскивали устье позвоночных артерий,

5 расположенное дистальнее места отхожде- ния каротид. Проксимальный участок обеих позвоночных артерий брали на лигатуру и перевязывали. Кожную рану послойно ушивали наглухо.

0

За несколько минут до опыта приготавливали переохлажденный пропанбутан (в дальнейшем - пропан). Для этого брали баллон с пропаном, открывали вентиль и позво5 ляли пропану в количестве 100-150 мл свободно вытекать в сосуд Дьюара, на дно которого предварительно помещали небольшой кусочек сухого льда. Пропан охлаждали, погружая его в медном стакане в жидкий азот.

Через 6 ч после операции наркотизированное гексеналом (в той же дозировке) животное опускалось в стакан с переохлажденным пропаном и затем быстро вскрывалась черепная коробка. С помощью микродолота, охлажденного в сосуде с сухим льдом, из замороженного головного мозга выдалбливали продолговатый мсзг, варолиев мост, гипоталамус и большие полушария (задний отдел) толщиной не более 3-5 мм. Выделенный замороженный блок быстро п реносили в смесь, состоящую из 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного (100°) этилового спирта в соотношении 1:9, предварительно охлажденную до -20°С в морозильной камере бытового холодильника. Срок инкубации блоков при данной температуре 4 ч.

Способ будет с успехом применен для выявления функционирующих капилляров практически в лю&ых органах экспериментальных животных. Он позволяет, с достаточной долей информативности, не только качественно, но и количественно оценить функциональное состояние терминального отдела микроциркуляторного русла в момент остановки кровотока, т.е. в прижизненных условиях. Для количественной характеристики эритроцит-содержащих капилляров использовали окуляр-микрометр и микрометрическую сетку, встроенные в обычный световой микроскоп. Общепринятыми методами измеряли плотность п, длину I, мкм, и диаметр d, мкм, капилляров в 1 мм препарата. Полученные показатели использовали для вычисления средней площади поверхности , мкм /мм , сред7Т о14

него объема V d In. в мкм /мм ,

jT, 5ОТ

поперечного сечения S д d п, мкм /мм ,

капилляров-параметров, характеризующих уровень регионарного кровенаполнения и транскапиллярный обмен. Все это имеет большое диагностическое значение при изучении закономерностей внутриорганно- го локального кровоснабжения в условиях нормы, действия различных экстремальных (стрессовых) факторов, при моделировании- ряда сосудистых заболеваний (гипертониче екая болезнь, атеросклероз, различные окклюзии, аномали, травма и т.д.), в процессе испытания вазоактивных фармакологических препаратов.

Опыт выявления функционирующих капилляров предлагаемым способом показал, что необходимо постоянно контролировать качество приготовления препаратов. Для этого желательно проводить параллельную обработку гистолЬгического материала от

опытных (например 5-6) и контрольных (например 2-3) животных. Если срезы, полученные от контрольных животных, будут отличаться от тех, которые были обработаны 5 ранее(например появление экстравазатов - признака деструкции капилляров, выраженного зеленовато-голубоватого фона, отсутствие капиллярного рисунка или его недостаточное контрастирование), то мате0 риал, полученный от опытных животных и обработанный в тех же условиях, не анализировался и уничтожался. После этого последовательно проверялась вся цепочка этапов метода и находилась причина, спо5 собствующая появлению того или иного методического артефакта (возможное неравильное приготовление и хранение реактивов, нарушение режима и сроков фиксации препаратов и т.д.), которая немедленно

0 устранялась. Затем на 2-3 контрольных животных проводился контроль воспроизводимости метода и если результаты не расходились с полученными ранее, то запускалась опытная серия животных (при обя5 зательном параллельном контроле). Необходимо отметить, что при правильном выполнении способа все причины, ведущие к методическим артефактам, как правило, без труда выявляются и устраняются.

0 Таким образом, предлагаемый способ выявления функционирующих капилляров технически легко воспроизводим, не требует дорогостоящей аппаратуры, уменьшает количество- используемых реактивов, осу5 ществляется в более короткие сроки без /худшения качества выявляемых гистологических структур. Одновременно он высокоинформативный и доступный в работе экспериментальной лаборатории различ0 ного профиля, способствует ускорению выполнения профильных научно-исследовательских работ.

Ф о р м у л а и 3 о б р е т е н и я Способ выявления функционирующих

5 капилляров, включающий глубокое замораживание органа, обезвоживание, фиксацию, парафинизацию блоков, резку их на микротоме, депарафинизацию срезов, окраску по Пикворсу, обезвоживание, просзет0 ление и заключение в бальзам, отличаю- щ и и с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляют одновременно в смеси, состоящей из

5 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного этилового спирта в соотношении 1:9, при температуре -20°С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной темпэ- сатуре в течение последующих двух суток.

Способ выявления функционирующих капилляров относится к области медицины, а именно к нормальной и патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и может быть использовано для функциональной характеристики терминального звена микроциркуляторного русла в нормальных и патологических условиях. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. Цель достигается тем, что процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляется одновременно в смеси, состоящей из 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного (100°) этилового спирта в соотношении 1:9, при температуре -20°С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной температуре в течение оставшихся 2 сут. Способ технически легко воспроизводим, позволяет в более короткие сроки с меньшим набором реактивов и оборудования изучить функциональное состояние внутриорганного капиллярного русла, осуществить контроль за действием различных вазоактивных препаратов на микроциркуляторную систему в условиях нормы и патологии, а также выявить локализацию и определить размеры очагов ишемии при моделировании ряда сосудистых заболеваний.