Способ определения активности эндопероксидпростагландинсинтетазы в биологическом материале Советский патент 1990 года по МПК G01N33/88 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано при определении активности фермента эндоперо- ксидпростагландинсинтетазы.

Цепь изобретения - повышение чувствительности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Биологический материал добавгхяют в реактщонную смесь объёмом 1 мл, содержащую 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 8,0, арахидоновую кислоту и га- мин. Активность фермента вычисляли . как начальную скорость по кривой по- . глощения кислорода и выражали в молях арахидоновой кислоты на Т мг белка в минуту, считая, что при превращении 1 моль кислоты потребляется 2 моль кислорода и что начальная концентрация кислорода в реакционной смеси равна 2,4 х . Интегральную кинетику поглощения кислорода исследовали также полярографическим методом с учетом неспецифичес- кого фонового поглощения кислорода. Концентрацию емина определяли спе- ктрофотометрически при 420 нм по поглощению восстановленного комплекса гемина с пиридином. Предиикуба- цию фермента с компонентами реакционной смеси проводили непосредственно в полярографической ячейке.

П р и М е р. В пробирку вносят , 0,1 мл полициклич ского углеводорода бенз(а)пиргна, растворенного в этиловом спирте, конечная концентраО

со

ция в исоцедуемых пробах объемом 1 мл

ч i

составляла 10

10

М или

252;;25,25 2, на 100 мкг фермента эндопероксидпростагландинсин- тетазы (микросомная фракция из везикулярных желез барана). Конечная конЦентрация этилового спирта в образ- цах не превьшала 20%. Обработка фер- мента эндопероксидпростагландинсин- тетазы бенз(а)пиреном в соотношении 252 мкг на 100 мкг белка вызывает ингибирование его активности, а обработка фермента бенз(а)пиреном в соотношении 25,2; 5,4 и 2,32 мкг

на 100 мкг - стимулирование активности фермента на 1,5-23%,

Предварительная обработка чистого фермента бенз(а)пиреном в соотношении (2,5-25,2):100 вызывает повышение ее активности на 25%, Предварительная же обработка бенз(а)пире- ном органов, и тканей животных в соотношении 2,5:100 - 25,2t100 (или 10 - ) -вызывает значительное увеличение содержания простагланди- нов Е и F в микросомах клеток печени крыс, которое составляет 45- 63% и 32-63% соответственно (табл.1). Это увеличение связано с активизацией фермента эндопероксидпроста- гландинсинтетазы после обработки бенз(а)пиреном,

Было изучено также изменение содержания простагландинов после предварительной обработки .бенз (а) пиреном в концентрации 2,52 мкг (Ю М) различньт тканей животных - сердца,

печени, почки,

10

15

20

25

30

40

селезенки и легких (табл. 2 и З), Как видно из табл. : и 3, самые значительные изменения наблюдаются в печени которые состав- ляют 71 и 62,6% и соответствуют увеличению содержания простагландинов Ей FSCI, а в других тканях увели- дз

35

0

5

0

5

0

чение активности простагландинов Е и варьирует в пределах 34-57%. Такое изменение содержания простагландинов Е и F,j,q после обработки бенз(а)пиреном является также следствием активирования фермента эндо- перрксидпростагландинсинтетазыо Исключение составляют легкие, в которых изменение содержания простагландинов сравнительно ниже. Это следует отнести либо к быстрой инактивации фермента,. или к быстрому вьшедению простагландинов из ткани.

Как видно из таблиц, после обработки бенз(а)пиреном наблюдается увеличение содержания простагландинов на 32-71% как в микросомах печени крыс, так и в различных тканях крыс.

Таким образом, бенз(а)пирен вызывает существенно увеличение активности фермента зндопероксидпростагландин- синтётазы, которое . составляет J52- 7-1%, Это позволяет повысить чувствительность определения фермента и существенно экономить биологический материал (ir 40-50%),

Формула изобретения

Способ определения активности зндопероксидпростагландинсинтетазы в биологическом материале путем выделения из исследуемой пробы фракции микросом, инкубации фермента с арахи- доновой кислотой в присутствии гемина и полярографической регистрации потребления кислорода, отличающийся тем, что, с целью новы- . шения чувствительности способа, био- логический материал предварительно обрабатывают бенз(а)пиреном, взятым в массовом соотношении к ферменту 2,5-25-,2:100,

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения активности эндопероксидпростагландинсинтетазы. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Способ заключается в обработке биологического материала при определении активности эндопероксидпростагландинсинтетазы бенз(а)пиреном при массовом соотношении с ферментным белком (2,5-25,2):100. При этом активность фермента возрастает на величину до 71%, что дает возможность повысить чувствительность способа и сократить количество используемого биологического материала. 3 табл.

436,7(100%)

415,7(100%)

303,9(73,1j(;2,6%)

Таблица 2

Контрольные Содержание простаглан- Содержание простаглан- пробы дина Е, пмоль/мг белка, дина Е, пмоль/мг белка, до обработкипосле обработки бенз(а)пиреном

Сердце520,4700,0 (134,,0%)

Печень741,21270,4 (171,4+5,6%)

Почка620,1873,6 (140,,1%)

Селезенка540.,5795,7 (147,2+4,4%)

Легкие. 74,38 2,2 (111,0+3,2%)

ТаблицаЗ

Контрольные Содержание простаглан- Содержание простаглан- пробы дина , пмоль/мг бел- дина Fgq, пмоль/мг белка, до обработки ка, после обработки

бенз(а)пиреном

Сердце520,4712,2(136,8М,0%)

Печень741,21205,6(162,,2%)

Почка620,1835,1(134,6jf3,8%)

Селезенка540,5852,3(157,6j+4,4%)

Легкие74,392,2(124,Ь+3,7%)