Способ определения мембранотропности ксенобиотиков Советский патент 1992 года по МПК G01N33/68 

« Изобретение относится к медицине, к области фармакологии и биотехнологии и может быть использовано при скрининге мембранотропных препаратов, а также в исследовании молекулярных механизмов адаптации мембранной системы клетки в ответ на действие разнообразных веществ.

Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа оценки мембранотропности ксенобиотиков.

На фиг. 1 приведены результаты активности глюкозо-6-фосфатазы в контроле (кривая t) и внесении в среду препарата амниоцен (кривая 2) при различных температурах инкубации; на фиг. 2 - кривые изменения активности глюкозо-6-фосфатазы в контроле (кривая 3) и при внесении препарата амниоцен (кривая 4) в зависимости от времени инкубации; на фиг. 3 - кривые изменения активности глюкозо-6-фосфатазы контрольных микросом (кривая 5) и при внесении препарата амниноцен (кривая 6). при инкубации их в 0,25 М сахарозе (а) и буферной системе (б).

Способ осуществляется следующим образом.

Крыс линии Вистар, самцы двухмесячного возраста, голодающих 12ч перед забоем, декапитируют. Печень перфузируют охлажденной до 2-4°С 0,25 М сахарозой, после чего ее продавливают через ручной пресс или тщательно измельчают ножницами. Полученный материал гомогенизируют в 0,25 М охлажденной сахарозе (2-4 С) в соотношении 1 т ткани к 4 мл указанного раствора в стеклянном гомогенизаторе с те- флоковым пестиком (8 тракций, 1500 об/мин) при постоянном охлаждений. Гомо- генат фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют его при 1000 g в течение 10 мин при2-4°С. Надосадочную жидкость центрифугируют при 11000 g в течение 15 мин при 2-4°С.

Полученный таким образом суперна- тант цинтрифугируют при ЮБОООд в течение 60 мин при 2-4°С. Осадок микросом суспендируем в 0,25 М сахарозе, содержащей буфер или же без него (в ручном

9

Ё

2

чэ

00

со ел

гомогенизаторе) до получения однородной суспензии. Определяют содержание белка в суспензии и разводят суспензию тем же раствором так, чтобы в 0,1 мл суспензии содержалось 800 мкг белка. Полученную суспензию разливают в пробирки по 1 мл и вносят по 20,50,100 мкл раствора испытуемого препарата. Образцы инкубируют при 4.16 и 26°С в течение 20 мин или 60 м при постоянном перемешивании системы. По истечении времени инкубации в образцах определяют активность глюкозо-б-фосфатр- зы одним из известных способов.

Результаты влияния препарата амнио- цен на активность глюкозо-6-фосфатазы в системах In vivo и In vitro приведены в табл. 1,

Из данных, представленных в табл, 1 следует, что в случае (0,6 мл препарата на 100 г массы тела) известного ингибируется активность фермента через 24 ч после введения животным препарата на 24%, доза 0,9 мл препарата оказывает такое же действие на активность фермента. В предлагаемом способе внесение 0,05 мл преперата на 1 мг белка макросом вызывает угнетение активности фермента на 70% по сравнению с контролем уже через 20 мин. Увеличение дозы препарата в 2 раза увеличивает угнетение активности в 1,3 раза, т.е. на 90% по сравнению с контролем (табл. 2),

Инкубация микросом с препаратом ам- ниоцен в дозе 20 мкл на 0,1 мл суспензии микросом, содержащей 800 мкг белка, при 16°С не вызываем статически достоверного уменьшения активности глюкозо-6-фосфа- тазы. Увеличение температуры инкубации до 19°С приводит к некоторому увеличению разницы в активности фермента между контролем и опытом по сравнению с 16°С. При температуре 20-26°С наблюдается наибольшая разница между активностью фермента контрольного и опытного варианта. Эта разница сохраняется и при 27°С, однако при этой температуре наблюдается снижение активности фермента в контрольном варианте, что может указывать на конфор- мационные изменения мембран при этой температуре (фиг. 1).

Таким образом, оптимальной температурой Инкубации микросом в системе In vitro при испытании ксенобиотиков на мем- боанотропность является температура 20- 26°С.

Что касается временных интервалов инкубации, то увеличение времени инкубации микросом до 80 мин в среди с 0,25 М сахарозой приводит к снижению активности глюкозо-б-фосфатвзы по сравнению с 1060-минутной инкубацией (фиг. 2). Учитывая, что исследуемый фермент является интегральным белком микросом и даже небольшие конформационные изменения мембран

сказываются на активности глюкозо-6-фос- фатазы, можно полагать, что инкубация микросом при 26°С в течение 80 мин приводит к конформационным изменениям структуры микросом, которые могут приводить к поте0 ре биоспецифичности их взаимодействия с ксенобиотиками. Подтверждением этому может служить резкое падение активности глюкозо-6-фосфатазы при 80-минутной инкубации с препаратом амниоцен (фиг, 2). С

5 этой точки зрения максимальное время инкубации не целесообразно увеличивать более 60 мин.

Минимальное время инкубации определено в 20 мин потому, что при 10-15-минут0 ных экспозициях угнетение активности фермента препаратом незначительно, а начиная с 20 мин обнаруживается достоверная разница между контролем и опытом (Фиг. 2).

5 Таким образом, инкубация испытуемых препаратор от 20 до 60 мин в системах выделенных мембран является оптимальной при определении мембранотропность ксенобиотиков,

0 При выборе состава среды инкубации руководствуются следующим: при суспендирован ии микросом в среде с буфером трис-HCI, рН 7,6, содержащем 0,05 М KCI и 0,005 М MgCl2 дольше сохраняется актив5 ность фермента, что указывает на стабилизацию их структуры. Однако внесение препарата в систему с микросом на основе сахарозы и буфера показало, что уменьшение активности глюкозо-6-фосфатазы на0 блюдается в большей степени в микросомах суспендированных в 0,25 М сахарозе (фиг. 3). Очевидно стабилизация структуры мембран, вызванная составом среды инкубации, снижает чувствительность мембран к дейст5 вию ксенобиотиков, На основании полученных результатов можно заключить, что микросомы суспендированные в 0,25 М сахарозе обладают большей чувствительностью, чем в среде с буфером.

0 3 предлагаемом способе о мембранот- ропности ксенобиотиков судят по уменьшению активности глюкозо-6-фосфатазы. Формула изобретения Способ определения мембранотропно5 сти ксенобиотиков путем исследования изменений в клетках печени крыс, подвергшихся воздействию ксенобиотика, отличающийся тем. что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, в качестве биологического материала используют препарат микросом печени, определяют в нем активность глюкозо-6- фосфотазы, при этом инкубируют препарат в растворе сахарозы при 20-26°С в течение

20-60 мин и при изменении активности фермента в сравнении с контролем делают вывод о мембранотропности ксенобиотика.

Использование: медицина, в частности фармакология и биотехнология, и может быть использовано в скрининге мембранот- ропных препаратов. Цель: ускорение и повышение чувствительности способа определения мембранотропности ксенобиотиков. Сущность изобретения: определяют активность мембранного фермента, например глюкозо-6-фосфатазы. в системе In vitro, для чего выделяют микросомы печени животных и инкубируют их в растворе на основе сахарозы при 20-26°С в течение 20- 60 мин в присутствии испытуемого ксенобиотика. 3 ил., 2 табл.

х & 2

1

I g

Таблица 1

Таблица 2

S 4 о

Сч

Г

2

I

Редактор М.Бланар

J б 56 Составитель В.Митюшин

Техред М.Моргентал

фиг 3

Корректор М.Шароши