СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННОГО ТРИТИЕМ ТРОМБОКСАНА B Советский патент 1995 года по МПК A61K38/00 

Изобретение относится к способам получения биологически активных соединений, меченных радиоактивными изотопами.

Тромбоксан (ТХ) А₃ образуется в клетках млекопитающих наряду с ТХА₂, но не обладает активностью ТХА₂. В связи с этим важным клиническим показателем для определения состояния гемостаза и других функциональных систем организма является соотношение концентраций ТХА₂ и ТХА₃, которое на практике определяют как соотношение концентраций их стабильных метаболитов ТХВ₂ и ТХВ₃. [³Н] ТХВ₃ и РИА-наборы для определения ТХВ₃ советскими и зарубежными фирмами не выпускаются.

Сведения о способе получения меченного тритием тромбоксана В₃ в патентной документации и научной литературе отсутствуют.

Структурные формулы тромбоксана В₃ и его предшественников:
Тимнодоновая кислота

Тромбоксан А₃

Тромбоксан В₃

Целью изобретения является получение меченного тритием ТХВ₃ с высокой молярной радиоактивностью.

Поставленная цель достигается выделением и частичной очисткой простагландин -Н-синтетазы (ПГ-Н-синтетазы) из везикулярных желез барана и ТХ-синтетазы из тробмоцитов человека, инкубацией [³H]-тимнодоновой кислоты (ТК) с концентрацией 10-100 мкМ с частично очищенным препаратом ПГ-Н-синтетазы при соотношении 0,1-1,1 мкмоль [³H] ТК на 1 мГ ПГ-Н-синтетазы (13-130 нмоль [³H] ТК на единицу активности ПГ-Н-синтетазы и препаратом частично очищенной ТХ-синтетазы с концентрацией 0,025-0,55 мг/мл в течение 25-40 мин при 25^оС.

Описание методов выделения и очистки ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы и характеристики полученных препаратов ферментов приведены в примере.

За единицу активности (Е) ПГ-Н-синтетазы принимают количество фермента, способное превращать 1 мкмоль арахидоновой кислоты (АК) за 1 мин при 25^оС в трис-буфере (рН 8).

На чертеже показана зависимость выхода [³H] ТХВ₃ от концентрации тромбоксансинтетазы при τ 0 (кривая 1) и τ 1 мин (кривая 2): А начальная концентрация [³H] ТК 25 мкМ, Б 75 мкМ; концентрация простагландин-Н-синтетазы 90 мкГ/мл, L-адреналина 2 мМ, гемина 2 мкМ; реакцию проводили в 20 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4) при 25^оС.

Сущность изобретения заключается в использовании двух очищенных ферментов, не содержащих эндогенных полиненасыщенных жирных кислот, которые вводят в реакционную смесь, содержащую [³H] ТК.

Оптимизацию синтеза [³H] ТХВ₃ проводят относительно выхода [³H] ТХВ ₃, рассчитанного исходя из радиоактивности взятой в реакцию [³H] ТК.

Препарат ПГ-Н-синтетазы получают из везикулярных желез барана путем измельчения желез гомогенизатором, осаждения микросомальной фракции центрифугированием, солюбилизации мембранных белков неионным детергентом Tween-20, фракционирования на колонке с DEAE-целлюлозой.

Препарат ТХ-синтетазы получают из осажденных при фракционировании крови тромбоцитов человека путем разрушения клеток ультразвуком, выделения микросомальной фракции центрифугированием, солюбилизации неионнымм детергентом Triton Х-100, хроматографии на колонке с DEAE-целлюлозой.

Все эксперименты проводят в калийфосфатном буфере (рН 7,4). Реакцию начинают добавлением в реакционную смесь, содержащую [³H] ТК, препарата ПГ-Н-синтетазы или смеси препаратов ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы, а останавливают добавлением раствора лимонной кислоты (до рН 3). Время между добавлением к реакционной смеси ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы обозначают τ
Определены зависимости выхода [³H] ТХВ₃ от концентрации препарата ТХ-синтетазы при двух начальных концентрациях [³H] ТК 25 и 75 мкМ и двух значениях τ 0 и τ 1 мин (см. чертеж). Как следует из представленных данных, выход [³H] ТХВ ₃ при τ 1 мин выше, чем при τ 0. Соотношение выходов [³H] ТХВ₃ при τ 1 мин и τ 0 пропорционально возрастает при увеличении концентрации ТХ-синтетазы и достигает значений 2,2-2,5 при начальных концентрациях [³H] ТК 25 и 75 мкМ. Максимальный выход [³H] ТХВ₃ ( τ 1 мин) равен 17-18% при концентрации [³H] ТК 25 мкМ и 12,5-13% при 75 мкМ.

Определение молярной радиактивности [³H] ТХВ₃, полученного при различных концентрациях исходной [³H] ТК и ТХ-синтетазы с помощью ВЭЖХ бромфенацилового эфира, меченного тритием тромбоксана, показывает, что ее значение не зависит от изменения перечисленных параметров и составляет 85-90% от молярной радиактивности соответствующей исходной жирной кислоты.

Обнаружен эффект существенного увеличения выхода [³H] ТХВ₃ при последовательном добавлении ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы к реакционной смеси, содержащей [³H] ТК, через определенный промежуток времени τ причем оптимальное значение τ равно 1 мин. Из приведенных результатов видно, что соотношение выходов [³H] ТВХ₃ при τ 1 мин и τ 0 при варьировании концентраций ТХ-синтетазы и [³H] ТК зависит только от концентрации препарата ТХ-синтетазы. Поэтому обнаруженный эффект может быть связан с неспецифической сорбцией исходной [³H] ТК на примесных белках, а также известным фактом ингибирования ТХ-синтетазы эйкозаполиеновыми кислотами (при начальной концентрации эйкозаполиеновой кислоты выше 100 мкМ ТХ-синтетазная активность заметно снижается). В случае τ > 0 и при избытке ПГ-Н-синтетазы оба эти ограничения становятся несущественными за счет быстрого превращения исходной [³H] ТК в лабильный промежуточный продукт, обладающий меньшей способностью сорбироваться на белках и не вызывающий ингибирования ТХ-синтетазы.

В этой связи возникают определенные требования к используемым для синтеза [³H] ТХВ₃-препарата ферментам: максимальная степень очистки (или удельная активность) и отсутствие примесей полиненасыщенных жирных кислот (включая АК и ТК), которые могут приводить к ингибированию ТХ-синтетазы, а также к разбавлению их радиоактивномеченых аналогов и, как следствие, к снижению молярной радиоактивности конечного продукта.

Использование частично очищенных (по предлагаемым методикам) препаратов ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы позволяет в отличие от использования цельных клеток, клеточных гомогенатов и мембранных препаратов максимально снизить или предотвратить полностью действие перечисленных отрицательных факторов.

Таким образом, инкубация [³H] ТК с концентрацией 10-100 мкМ с очищенным препаратом ПГ-Н-синтетазы (0,1-1,1 мкмоль [³H] ТК на 1 мГ ПГ-Н-синтетазы или 13-130 нмоль меченой тимнодоновой кислоты на 1Е ПГ-Н-синтетазы) и препаратом частично очищенной ТХ-синтетазы с концентрацией 0,22-0,55 мГ/мл в присутствии L-адреналина (2 мМ) и гемина (2 мкМ) в калийфосфатном буфере (рН 7,4) при 25^оС в течение 25-40 мин приводит к образованию [³H] ТХВ₃ с выходом 12-18%
П р и м е р. Получение меченного тритием ТХВ₃.

1. Получение препарата ПГ-Н-синтетазы.

100 г везикулярных желез барана (-60^оС) помещают в 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера (рН 8), содержащего 10 мМ Na₂˙ EDTA, 1 мМ диэтилдитиокарбамат (DEDTC) и 0,1% (w/v) Tween-20, измельчают до гомогенного состояния с помощью Waring Comm. Blender (10 раз по 15 с интервалом 30 с) и центрифугируют 30 мин при 4500 g. Полученный супернатант (около 230 мл) фильтруют через четыре слоя марли и центрифугируют 90 мин при 95˙10³ g. Осадок (микросомальная фракция) суспендируют в 20 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 2 мМ Na₂ ˙EDTA и 0,5 мМ DEDTC, с использование стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестиком, доводят объем суспензии буфером до 180 мл и повторно центрифугируют 90 мин при 95˙10³ g. Полученный осадок ресуспендируют в 20 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4) с 0,5 мМ EDTA и 0,1 мМ дитиотреитолом (DTT) (буфер А), добавляют 9 мл 10% (w/v) Tween-20, доводят объем до 60 мл буфером А и центрифугируют 120 мин при 95˙10³ g. Супернатант (около 50 мл), содержащий ПГ-Н-синтетазную активность, отбирают и наносят на колонку с DEAE-целлюлозной (2,5 х30 см), уравновешенную в буфере А, содержащем 0,1% (w/v) Lubrol РХ. Фракцию не связавшихся с DEAE-целлюлозой белков собирают и используют в дальнейшем в качестве частично очищенного препарата ПГ-Н-синтетазы. Все операции при выделении фермента проводят при температуре 4^оС.

В результате приведенной процедуры получают 75 мл препарата ПГ-Н-синтетазы с концентрацией белка 0,9 мг/мл и специфической активностью 8,3 мкмоль арахидоновой кислоты в 1 мин на 1 мГ белка (25^оС, 50 мМ трис-буфер, рН 8).

2. Получение препарата тромбоксансинтетазы.

К 60 г осажденных центрифугированием тромбоцитов человека (получены на Центральной станции переливания крови, Москва), которые хранили до использования при -60^оС, добавляют 20 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 10 мМ Na₂˙ EDTA, 0,1 мМ дитиотреитол и 1,15% KCl (буфер Б), гомогенизируют в Waring Comm. Blender (10 раз по 30 с промежутками в 30 с), обрабатывают ультразвуком 20 раз по 5 с с промежутками в 25 с (22 Гц, амплитуда 14-16 единиц между пиками). Полученный таким образом клеточный гомогенат (около 250 мл) центрифугируют 25 мин при 4000 g, после чего супернатант (около 180 мл) рецентрифугируют 90 мин при 90 ˙10³ g. Осадок (микросомальная фракция) суспендируют в буфере Б, доводят объем до 180 мл и центрифугируют 90 мин при 90˙10³ g. Полученные в осадке микросомы ресуспендируют в 20 мМ калийфосфатном буфере, содержащем 1 мМ Na₂ ˙EDTA, 0,5 мМ DTT, 10% глицерина и 1% Lubrol РХ, доводят объем до 90 мл, выдерживают 1 ч при + 4^оС и центрифугируют 120 мин при 90˙10³ g. К 80 мл полученного супернатанта (фракция солюбилизированного детергентом фермента) добавляют 16 мл 0,2 М калийфосфатного буфера и 25-30 мл DEAE- целлюлозы "Whatman", уравновешенной в 50 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 1 мМ Na₂˙EDTA, 0,1 мМ DTT, 10% (w/v) глицерина (буфер В), и выдерживают 30 мин при 4^оС с перемешиванием. Не связавшуюся с DEAE-целлюлозой фракцию, содержащую тромбоксансинтетазную активность, отделяют центрифугированием (15 мин при 3500 g). Оставшийся в осадке гель повторно суспендируют в 25-30 мл буфера В, выдерживают 10 мин при 4^оС и центрифугируют.

В результате получают 75 мл препарата тромбоксансинтетазы с концентрацией белка 1,09 мг/мл и специфической активностью 0,13 мкмоль ПГН₂ в 1 мин на 1 мг белка (25^оС, 20 мМ калийфосфатный буфер, рН 7,4).

3. Получение [³H] ТХВ₃.

К раствору 2,2 ГБк (0,25 мкмоль) [5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 19 (n)-³H] тимнодоновой кислоты с молярной радиоактивностью 9,25 ПБк/моль в 100 мкл этилового спирта добавляют 0,5 мл 0,2 М калийфосфатного буфера (рН 7,4), 100 мкл 100 мМ раствора L-адреналина, 100 мкл 100 мкМ раствора гемина, предынкубируют реакционную смесь 5 мин при 25^оС и добавляют 1 мл выдержанного при 25^оС и препарата ПГ-Н-синтетазы. Через 1 мин добавляют 5 мл проинкубированного при 25^оС препарата ТХ-синтетазы и продолжают инкубацию в течение 30 мин при той же температуре. Реакционную смесь подкисляют 2 М раствором лимонной кислоты (до рН 3) и экстрагируют продукты реакции этилацетатом (3х30 мл). При этом в экстракте оказывается не менее 90% от исходной радиоактивности. Экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют, упаривают и растворяют в метаноле. Выход [³H] ТХВ₃ определяют с помощью ТСХ продуктов реакции в системе растворителей А (хлороформ метанолуксусная кислота 90:9:1, v/v/v). Распределение радиоактивных продуктов по пластинке определяют с помощью радиохроматосканера. Очистку [³H] ТХВ₃ осуществляют с помощью препаративной ТСХ на силикагельных пластинках "Силуфол" (ЧСФР) в системе растворителей А. [³H] ТХВ₃ элюируют с пластинки этилацетатом (3х3 мл), затем растворитель упаривают и вещество растворяют в 10 мл этанола.

Получают 0,37 ГБк (17% ) [³H] ТХВ₃ с молярной радиоактивностью 8,25 ПБк/моль и радиохимической чистотой 98%

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения тромбоксана B₃ Инкубируют [³H] -тимнодоновую кислоту (ТК) с препаратом простагландин-Н-синтетазы (ПГН) при соотношении 0,3 3,3 мкмоль [³H] ТК на 1 мг ПГ-Н-синтетазы в течение не более 4 мин, после чего добавляют препарат частично очищенной тромбоксансинтетазы и инкубируют 25 40 мин при 25°С. 1 ил.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННОГО ТРИТИЕМ ТРОМБОКСАНА B₃, включающий инкубацию [³H] -тимнодоновой кислоты, L-адреналина и гемина с очищенными препаратами простагландин-H-синтетазы и тромбоксансинтетазы, экстракцию продукта органическим растворителем с последующей очисткой целевого продукта. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, используют [³H] -тимнодоновую кислоту с концентрацией 10 - 100 мкМ в соотношении 13 130 нмоль на единицу активности простагландин-H-синтетазы, а препараты простагландин-H-синтетазы и тромбоксансинтетазы добавляют в реакционную смесь последовательно с интервалом 1 мин.