Способ определения активности простагландин-синтетазы в тромбоцитах Советский патент 1989 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и может быть использовано для определения активности простагландин (ПГ)- синтетазы в тромбоцитах (ТЦ).

Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа.

Цель достигается тем, что взятие крови проводят с цитратным буфером рН 4,5 и обогащенную ТП плазму доводят до рН 6,5 дпя повышения устойчивости ТЦ к процедурам выделения; вводят временной интервал выдержки ТЦ (не менее 1 ч ) для восстановления их реакционной активности; непосредственно перед инкубацией проводят колоночную хроматографию для очистки С С арахидоновой кислоты (АК ) от образующихся при хранении

перекисных соединений, обладающих ингибирующим влиянием на активность ПГ-синтетазы; инкубацию проводят в оптимальных условиях при рН 7,4 для повышения синтеза ПГ изолированными ТЦ; образованные ПГ отделяют колоночной хроматографией от непрореагировавшего субстрата для устранения фонового загрязнения хроматограЛи- ческой пластинки меченой АК.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь отбирают в пластиковые пробирки с.цитратным буфером рН 4,5 (из расчета 1:9 по объему), содержащим 85 мМ цитрата натрия, 65 мМ лимонной кислоты и 58 мМ декстрозы. Для удаления лейкоцитов и эритроцитов

СП

о

О)

00

ел

00

315аб358

кровь центрифугируют в течение 10 мни при 200 g. Обогащенную ТЦ плазЬ5у переносят в чистые пробирки, подкисляют 0,15 М лимонной кислотой до рН 6,5 (0,025 мл на 1 мл плазмы)и центрифугируют в течение 10 ш при 1000 g, Осадок ТЦ ресуспендируют в модифицированном Тирод-Хепес-буфере рН 6,5 (137 мМ NaCl; 2,68 0,416 мМ мМ MgCl ; 5 мМ декстрозы, 10 мМ HEPES; 0,35% БСА; 50 ед/ш1 гепарина; 0,05 мг/мл апиразы). ТЦ поворно осаждают при 800 g в течение 10 мин, ресуспендируют в безкальцие- 15 вом Тирод-Хепес-буфере рН 7,4 без БСА, гепарина и апиразы (в 1/5 от исходного Объема) и осуществляют просчет ТЦ под микроскопом или с помощью соответствующего гематологи- 20 ческого анализатора. Исследование проводят не ранее чем через 60 мин после получения конечной суспензии ТЦ примерно через 2,5 ч с момента взятия крови ). В день проведения 25 эксперимента соответствующее количество С АК выпаривают под азотом, растворяют в 0,1 мл хлороформа (хлф) и наносят на колонку, заполненную 0,5 г кремниевой кислоты (;0 J-200 меш)30 р. i ,5 мл хлф . Г, J АК, количественно элюируют 7 МП хлороформа, выпари- зают под азотЬм и растворяют в таком колр1честве 0,05 М Трис-НС1-буфе- ре (рН 8), чтобы лолучить 5 нмоль 35 АК 13 0,05 мл буфера. Инкубацию проводят в течение 10 :-шн при 37°С, концентрации ТЦ , АК 5 мкМ Е объеме 1 мл, Реакция начинается с момен- i: добавления АК, идет при пос-40 тоянном перег ешивамии и останавливает- СА добавлением охлажденной на льду смеси хпф: метанол: 1% м равьиная кислота (1,2:1,2:0,1) из расчета 2,5 объема на 1 объем реакционной 45 смеси. Нижнюю хлф, фазу выпаривают под азотом и растворяют в 0,1 мл хлф. Е качестве контроля проводят инкубацию С АК (5 мкМ) в отсутствии ТЦ. Хлф, экстракт (0,1 мл) наносят на ,„ колонку с кремниевой кислотой. Сначала элюируют непрореагироьавшую АК 7 мл хлф, а затем С ПГ 5 мп 20%- ного метанола в хлА, Сконцентрированный под азотом элюат ПГ нано- ее сят на хроматографическую пластинку Silufol (ЧССР) совместно со стандартными ПГ - тромбоксан В . (ТХВ) , ПГЕ/j и nPFtj H разделяют в системе

диэтиловый эфир:метанол:ледяная уксусная кислота (90:1:2).

Пятна на пластинках, соответствующие стандартным ПГ, проявляют в парах иода, вырезают и помещают в сцин тилляционные флаконы. После экстракции ПГ метанолом добавляют сцинтил- ляционную жидкость и просчитывают радиоактивность на р-счетчике. Активность ПГ-синтетазы оценивают по количеству нмоль ПГ, синтезируемых ТЦ из меченого субстрата за 10 мин инкубации, в расчете на определенное количество ТЦ (10),

Пример 1, 12мл крови смешивают с 1,1 мл цитратного буфера рН 4,5 и центрифугируют в течение 10 ми при 200 g, В чистые пробирки переносят 3 мл обогащенной ТЦ плазмы, добавляют 75 мкл 0,15 М раствора лимонной кислоты и центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин. Осадок ТЦ ресуспендируют в 1 мп Тирод-Хепес- буфера рН 6,5 (с гепарином, БСА и апиразой) с последующим доведением до 3 мл, ТЦ повторно центрифугируют при 800 g в течение 10 мин, ресуспендируют в 0,6 мл Тирод-Хепес-буфера рН 7,4 и 40 мкл суспензии отбирают для просчета концентрации ТЦ на гематологическом анализаторе СЕЛЛ-Дин Э (Италия). После разбавления пробы 160 мкл физиологическим раствором получают в 1 мл анализируемого раствра 2,9 10 ТЦ. Из флакона с исходным раствором АК (54,9 мКл/ммоль) в стеклянную силиконированную пробирку отбирают 11 мкл кислоты, выпаривают под азотом, растворяют в 0,1 мл хлф и наносят на колонку с 0,5 г- кремниевой кислоты (100-200 меш. Bio Rad Lab, CUIA) , суспендированной в 1,5 мл хлф С АК, элюируют 7 мл хлф , 0,1 мл элюата отбирают в сцин- тилляционный флакон, выпаривают, добавляют 10 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8. После просчета радиоактивности получают 34 800 расп/мин, С учетом этих данных оставшийся хлф, элюат выпаривают под азотом и растворяют в 1,97 мл 0,05 М Трис-НС1. Для проведения реакции в пробирку добавляют 0,138 мл суспензии ТЦ (2x10 ТЦ 0,812 мл 0,05 М трис-НС буфера рН 7,4. После помещения в водяную баню (37°С) вносят 0,05 мл 1 С АК (5 нмоль) и через 10 мин 2,5 мл охлажденной смеси хлф:метанол;1%-ная муравьиная кислота в соотношении 1,2:1,2: :0,1. Для контроля проводят инкуба цию с в отсутствии ТЦ. Нижнюю хлф.фазу выпаривают под азотом растворяют в 0,1 мл хлф. и наносят на колонку с кремниевой кислотой (о,5 г), суспендированной в I ,5 мл хлф. Непрореагировавшую С j - АК элюируют 7 МП хлф, а ПГ - 5 мл 20%- ного метанола в хлф. Выпаренную до 0,05 МП ПГ фракцию наносят на хро- матографическую плacfинкy Silufol

(15x15 см, ЧССР) вместе с ПГЕ

а

ПГР.

V

Пример 2. Выделение изолированных ТЦ и очистку меченого субс рата осуществляют по примеру I, снижая при инкубации рН до 7,0 (исполь зуют те же ТЦ и С С J - АК). В реаки (по 10 мкг каждого). Пластин- 15 пробирку добавляют 0,138 мл

ку помещают в хроматографическую камеру с 50 мл системы растворителей диэтиловый эфир: метанол: ледяная уксусная кислота (90:1:2) и после трехкратного хроматографирования высушивают и проявляют в парах иода. Получены следующие значения Rf для ТХВ 0,64; nrEj 0,33, ПГГ,0,23. Пятна на пластинке, соответствующие стандартным ПГ, вырезают, помещают в сцинтилляционные флаконы и после экстракции ПГ 0,1 мл метанола добавляют 10 мл сцинтиллятора ЖС-8. Просчет радиоактивности проводят на р-счетчике Mark-Ill (Нидерланды). После соответствуквдего пересчета идентифицированной радиоактивности (распады в мин) в активность ПГ-син- тетазы (нмоль ПГ на 10 ТЦ ) получили следующие данные, представленнь е в т абл. I .

Т а б л и ц а 1

20

25

30

35

суспензии ТЦ (пример 1) и 0,812 мл 0,05 М Трис-НС1 буфера рН 7,0. После помещения в водяную баню (37°CJ вводят С АК и через Ю мин 2,5 МП охлажденной смеси хлф:метанол : 1%-ная муравьиная кислота (1,2: :1,2-0,1. Последующие процедуры экстракции, очистки образованных ПГ от непрореагировавшего субстрата, разделения метаболитов ТСХ и просчет радиоактивности проводят по примеру 1. Активность ПГ-синтетазы в этих условиях равна 1,67 нмоль ТХВ на 10 ТЦ (44533 расп/мин радиоактивности в соответствующем пятне хрома- тографической пластинки), что состав ляет 6,7% от количества добавленного субстрата. Небольшое (на 20%) сни-. жение активности ПГ-синтетазы ТЦ при pPi 7,0 связано со смещением оптималь ного для работы этого фермента рН 7,4 в сторону преимущественного образования в ТЦ липооксигеназного метаболита АК. С уменьшением рН инкубационной среды с 7,4 (пример 1) до 7,0 отмечается незначительное сни жение синтеза и других ПГ:Е с 0,21 до 0,17 и F , с 0,08 до 0,07 нмоль на 10 ТЦ.

Таким образом, изолированные ТП превращают - АК главным образом в ТХВ (2,09 нмоль на , 8,4% от количества добавленного субстрата нгш 88% от общего образования ПГ} и небольшие количества ПГЕ-i и ПГГ (0,33 и 0,07 нмоль на соответственно). По образованию ТХВ, как основного метаболита АК в ТЦ, следует судить об активности ПГ 1506358

:

10

синтезирующего фермента в ТЦ. В контрольном опыте лолучены фоновые значения радиоактивности (не выше 80 расп/мин), что соответствует количеству ПГ не более чем 0,003 нмоль на 10 ТЦ и входит в ошибку разброса, результатов данного опыта.

Пример 2. Выделение изолированных ТЦ и очистку меченого субстрата осуществляют по примеру I, снижая при инкубации рН до 7,0 (используют те же ТЦ и С С J - АК). В реак15 пробирку добавляют 0,138 мл

15 пробирку добавляют 0,138 мл

20

25

30

35

40

45

50

55

суспензии ТЦ (пример 1) и 0,812 мл 0,05 М Трис-НС1 буфера рН 7,0. Пос. ле помещения в водяную баню (37°CJ вводят С АК и через Ю мин 2,5 МП охлажденной смеси хлф:метанол : 1%-ная муравьиная кислота (1,2: :1,2-0,1. Последующие процедуры экстракции, очистки образованных ПГ от непрореагировавшего субстрата, разделения метаболитов ТСХ и просчет радиоактивности проводят по примеру 1. Активность ПГ-синтетазы в этих условиях равна 1,67 нмоль ТХВ на 10 ТЦ (44533 расп/мин радиоактивности в соответствующем пятне хрома- тографической пластинки), что составляет 6,7% от количества добавленного субстрата. Небольшое (на 20%) сни-. жение активности ПГ-синтетазы ТЦ при pPi 7,0 связано со смещением оптимального для работы этого фермента рН 7,4 в сторону преимущественного образования в ТЦ липооксигеназного метаболита АК. С уменьшением рН инкубационной среды с 7,4 (пример 1) до 7,0 отмечается незначительное снижение синтеза и других ПГ:Е с 0,21 до 0,17 и F , с 0,08 до 0,07 нмоль на 10 ТЦ.

V

I

П р и М е р 3. Выделение ТЦ и инкубацию с АК проводят по примеру 1. При этом используют те же ТЦ, но неочищенную от примесей С С АК (2,75 мкл исходного раствора С АК добавляют при инкубации в опытную и контрольную пробы ). Условия проведения инкубации, последующая экстракция и ТСХ аналогичны описанным в примере 1 . Перед проведением ТСХ не проводят очистку образованных ПГ от непрореагировавшего субстрата.

Полученные данные представлены Б Т абл. 2.

5063588

кий, и может быть обусловлено присутствием примеси непрореагировавшего субстрата.

Использование предлагаемого способа позволяет определять активность ПГ-синтетазы с точностью до 95% и чувствительностью не менее 1 нмоль анализируемых ПГ, Кроме этого, разброс показаний составляет менее 10% за счет использования интактных ТЦ и проведения инкубации в оптимальном для фермента режиме работы.

10

Изобретение относится к медицине , в частности, к клинической биохимии, и может быть использовано для определения активности простагландин-синтетазы в тромбоцитах. Цель изобретения заключается в повышении точности и чувствительности способа. Сущность изобретения состоит в том, что для определения активности простагландин-синтетазы тромбоциты из крови выделяют в цитратном буфере при рН 6,5, выдерживают в течение 1 ч, предварительно проводят очистку [¹⁴С] арахидоновой кислоты с помощью хроматографии на кремниевой кислоте, инкубируют ее с тромбоцитами при рН 7,4, а перед определением радиоактивно меченных простагландинов проводят разделение продукта от непрореагировавшего субстракта с помощью хроматографии на кремниевой кислоте. 2 табл.

В контрольном эксперименте при

отсутствии очистки образующихся ПГ от непрореагировавшей С АК в зонах хроматографической пластинки, соответствующих стандартным ПГ (ТХВ ПГЕ и ПГЕу) ,отмечены повышенные значения радиоактивности по сравнению с соответствующими значениями в контрольном опыте примера № 1. Это указывает на фоновое загрязнение радиоактивным субстратом, проходящим через всю пластинку с фронтом растворителя и вносяпщм погрешность в измерение ПГ. В условиях данного эксперимента выявлено примерно 30% снижение синтеза ТХВ (по сравнению с соответствующими значениями в примере 1 ), что связано с использованием неочищенной АК, образующей при хранении перекиси, подавляющие активность ПГ-синтетазы. Некоторое ..

увеличение синтеза ПГР„ . (на 16%)

,. -

может быть мнимым, так как уровень

образования этого ПГ достаточно низ

Формула изобретения

Способ определения активности простагландин-синтетазы в тромбоцитах, включающий выделение тромбоцитов, инкубацию арахидоновой : кислоты, экстракцию и тонкослойную хроматографию с последующим определением радиоактивности в зонах, соответствующих стандартным простаглан- динам, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, тромбоциты из крови вьщаляют в цитратном буфере при рН 6,5, выдерживают в течение 1 ч, предварительно проводят очистку С арахидоновой кислоты с помощью хроматографии на кремниевой кислоте, инкубируют ее с тромбоцитами при рН 7,4, а перед определением радиоактивно меченых простагланди- нов проводят разделение продукта от непрореагировавшего субстрата с помощью хроматографии на кремниевой .кислоте.