Способ определения фосфамида в биологических средах Советский патент 1991 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинических лабораториях для определения уровня содержания пестицида при интоксикации фосфорорганическими соединениями.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа.

Способ определения фосфамида в биологических средах осуществляется следующим образом.

Отбирают для анализа 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл эритроцитов после разделения пробы крови на фракции сыворотки и эритроцитов. Приливают к пробе по каплям 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты до полной коагуляции белков и других коэкстрактивных веществ. Затем добавляют 2 мл дистиллированной воды, перемешивают и прибавляют по каплям 10%-мый раствор едкого натра до получения нейтральной реакции раствора (рН 7),рН раствора можно контролировать по универсальной лакмусовой бумаге. Экстрагируют фосфамид трижды свежими порциями хлороформа по 3-5 мл, встряхивая по 30 мин на холоду, при 0-5°С (можно использовать баню со льдом). Экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, на который предварительно насыпают 1-2 г сернокислого безводного натрия. Отгоняют органический растворитель до объема раствора примерно 0,1-0,2 мл на ротационном или другом аналогичном испарителе при темпеС hO

N

СА

ю

ратуре бани 40-50°С. При нагревании вещества при высоких температурах может произойти его изомеризация. Оставшийся в отгонной колбе растворитель испаряют в открытой колбе в вытяжном шкафу. К сухому остатку приливают 1 мл ацетона или гексана и анализируют раствор на содержание фос- фамида на газовом хроматографе с электронно-захватным детектором (или детектором постоянной скорости рекомбинации-ДПР). Условия хроматографирова- ния: колонка стеклянная длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм, насадка колонки - хроматон N-AW-DMCS (зернение 0,16-0,20 мм), пропитанный 5% ХЕ-60, температура колонки 190°С, испарителя 210-220°С, детектора 190°С..Скорость потока газа-носителя азота особой чистоты 60 мл/мин. Продувка детектора 6 л/ч. Шкала электрометра 20 10 12-50 -10 А. Время выхода (время удерживания) фосфамида 7,5 мин. Минимально детектируемое количество фосфамида 0,2 нг в 6 мкл раствора. Нижний предел обнаружения фосфамида в эритроцитах и сыворотке крови 0,06 мкг/мл или 2,62 -10 мкмоль/мл, Относительная ошибка определения фосфамида в пробах эоитооцитов крови по способу-прототипу ±96,5%, а по предлагаемому способу эта ошибка ±13,1% в эритроцитах иЈ8,5% в сыворотке крови. Фосфамид определяется в присутствии его метаболитов.

П р и м е р 1. Определение фосфамида в тканях внутренних органов.

Отбирают для анализа 5 г гомогенизированной ткани внутренних органов (печень, почки, сердце, легкие, селезенка, стенка желудка), приливают 5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают содержимое. Добавляют 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (примерно 1-2 мл) для осаждения белков. После перемешивания приливают 10 мл воды, снова переме0

5

0

5

0

5

0

шивают и затем добавляют 10%-ный раствор едкого натра (примерно 0,5-1 мл) до получения рН раствора 7. Экстрагируют фосфамид трижды по 15 мл хлороформа, встряхивая в течение 30 мин при охлаждении. Порции экстракта объединяют, фильтруют через бумажный фильтр с насыпанным на него безводным сернокислым натрием и далее поступают по примеру 1: отгоняют растворитель до объема раствора примерно 0,2 мл, упаривают остаток в вытяжном шкафу. К сухому остатку при л ива ют ацетон или гексан и аликвотную часть раствора (1- 6 мкл) вводят в хроматограф. Условия анализа: колонка длиной 1 м, насадка колонки хроматон М-А Л/-ДМС5, пропитанный 5% ХЕ-60. Температура колонки 190°С, детектора 190°С, испарителя 210-220°С. Скорость газа-носителя 70 мл/мин. Шкала электрометра 20-50 А. Время удерживания фосфамида 6,4 мин. Нижний предел обнаружения фосфамида в тканях внутренних органов 0,017 мкг/г или 7,42 -10 5мкмоль/г.

Относительная ошибка определения фосфамида в тканях ±/,2% .

Форму.ла изобретения

Способ определения фосфамида в биологических средах путем экстракции его органическим растворителем, удаления белков, высушивания экстракта растворения и последующего газохроматографиче- ского анализа, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, осаждение белков проводят до экстракции, экстракцию проводят при нейтральном рН, а газохроматогра- фический анализ осуществляют с помощью электронно-захватного детектора при температуре колонки 190°С и скорости газа-носителя 60-70 мл/мин.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения уровня содержания пестицида-фосфамида при интоксикации фосфорорганическими соединениями. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа. Для этого проводят осаждение белков, мешающих определению, добавлением 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. После восстановления рН раствора до нейтрального значения экстрагируют исследуемое вещество органическим растворителем, высушивают экстракт. Растворяют сухой остаток в 1 мл ацетона или гексана и осуществляют газохроматографи- ческий анализ с помощью электронно-захватного детектора при температуре колонки 190°С и скорости газа-носителя 60- 70 мл/мин. Нижний предел обнаружения фосфамида в эритроцитах и сыворотке крови 0,06 мкг/мл, в тканях внутренних органов 0,017 мкг/г. Относительная ошибка определения фосфамида в сыворотке крови ± 8,5%, в эритроцитах ± 13,1%, в тканях внутренних органов ±7,2%. Ј