Способ получения полипептида, обладающего иммуногенными свойствами НВ @ А @ Советский патент 1991 года по МПК C12N15/51 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения вакцин против гепатита В.

Композиция, используемая для приготовления вакцин, отвечающая изобретению, содержит почти сферические полипептидные частицы (или образована из этих частиц), которые обладают им- муногенными и иммунологическими свойствами, характерными для антигена HBS Ag и имеют размеры 18-25 нм, особенно 20-22 мм, и плотности, позволяющие их выделение в интервале плотности 1,20-1,22 г/мм в градиенте плотности на основе CsCl, и такую степень полной чистоты, что отсутствуют частицы Dane s ( и антигены HBS, включая НВС. Предлагаемая композиция отличается тем, что указанные сферические частицы содержат также рецептор поли- меризованного человеческого альбуми - на. В частности, полипептидные частицы, отвечающие изобретению, могут содержать значительные пропорции ч полипептидов, имеющих мол.вес порядка 34000 дальтон, и такие полипепти- ды составляют по количеству более 10%, предпочтительно более 20% от общего количества полипептидов указанных частиц.

Пример 1. Построение векторов.

А. Построение плаэмиды pSVS,

С& IsD

СП

СО

со

1C

см

Плазмида pSVS позволяет выразить S участок (пред-S участок и S ген) под контролем раннего промотора вируса SV 40.

Фрагмент Bglll 2,3 кв выделяют из рСРЮ. Плазмида рСРЮ содержит двух- звенный полимер (димер) от головной до хвостовой части генома HBV. Этот фрагмент начинается с десяти нуклео- тидов перед АТС пред-S участка и завершается 1,1 кв после стоп кодона ТАА гена S. Он содержит путативную точку полиаденилирования информационной рибонуклеазы (mRNA) рецептора , и инициируемую точку транскрипции гена S.

Используют ранний промотор SV 40, содержащийся в плазмиде PSV 2 gpt (АТСС 37145), в котором ген gpt

Е. coli слит с PVuII Hindlll фрагмента размером 348 п.о. раннего участка SV 40. Этот фрагмент включает ранний и поздний промоторы иного происхождения, чем репликация SV 40 точку ини- циирования транскрипции ранних вестников, и 72 основные пары, которые повторяются последовательно.

Фрагмент Bglll размером 2,3 кв пар оснований от рСРЮ вставляют в единственную точку Hindlll плазмиды pSV посредством связывания концов фрагмента ДНК, которые имеют тенденцию к раскрытию посредством ДНК поли меразы Кленова. После изучения ре- комбинантных плазмид отбирают клон (pSV H44), в котором участок, кодирующий HBS, ориентирован относительно промотора SV 40 таким образом, что обеспечивает его выражение. Такое построение подтверждается ограничительными картами. Была определена нуклеотидная последовательно на стыке двух фрагментов SV 40 и HPV.

Плазмида pSVS построена из трех фрагментов, полученных от трех плазмид: фрагмент 2,5 кв PVuI - XLol, полученный от pSVH4; фрагмент 1,9 кв Xhol BglHI, полученный от рСРЮ; фрагмент 1,0 -BamHI, PVuI от pBR 322

Полученная в результате плазмида

pSVS (5,4 кв) отличается от pSV H4 отсутствием участка gpt и от последовательностей SV 40 ДНК, следующих за данной последовательностью, нали- чием фрагмента EcoRI - BamHI плазмиды pBR 322.

Б„ Построение плаэмиды pSVS.

Фрагмент, содержащий dhfr.

0

5

$

5

5

0

0

Плазмиду pHTV dhfr после линейного выравнивания ферментом PVuI частично расщепляют ферментом Hindlll с освобождением некоторых фрагментов, из которых один фрагмент 4400 Ьр. (пар оснований) содержит LTR от MMTV, с ДНК от dhfr, интрон от tAg от SV 40, точку полиаденилирования в ранних генах SV 40, фрагмент EcoRI- PVuI плазмиды pBR 322.

Фрагмент HBV ДНК.

Плазмиду pSVS фрагментируют посредством PVuI, затем Hindlll с высвобождением таким образом фрагмента 4676 п.о., содержащего PVuI-PVuII Фрагмент, содержащий источник репликации pBR 322; источник репликации и ранний промотор вируса SV 40; фрагмент Bglll размером 2,3 т.п.о. от HBV, содержащий участки, кодирующие пред-S и S ген, а также сигнал полиаденилирования этого гена; фрагмент BamHI - Hindlll плазмиды pBR 322.

Лигирование данных фрагментов,,

После очистки данные две фрагмента соединяют по сайтам PVuI и Hindlll так что восстанавливается устойчивость pBR 322 к ампициллину.

В рекомбинантном векторе зоны транскрипции S участка и гена dhfr ориентированы в одинаковом направлении и разделены примерно 300 п.о. плазмиды pBR 322.

ДНК, кодирующую dhfr, получают также от pSV2 dhfr (ATCC 337146), pSV3 dhfr (ATCC 37147) или pSVS dhfr (ATCC 31148).

Расположение гена dhfr таким образом, что он находится под контролем слабого промотора (LTR от MMTV) и гена HBV таким образом, что он находится под контролем сильного промотора (раннего промотора SV 40), повышает эффективность экспрессии гена.

Пример 2. Трансфекция животных клеток.

Перенос и выражение плазмиды pSVS dhfr в СНОо Трансформируют клетки СНО dhfr плазмидой pSVS dhfr, продукт этих клеток испытывают методом радио- иммуноанализа (RIA) в поверхностном слое клеточных культур. 60% клонов dhfr представляет собой HBS Ag. Скорость синтеза HBS Ag была относительно, низкой между 1 и 20 мг/106 клеток в течение 24 ч.

Увеличение последовательностей HBS.

Культивирование клонов СНО HBS kg1 в присутствии метотриксате (МТХ), аналога фолиевой кислоты в ингибиторе dhfr обуславливает увеличение числа воспроизведений гена dhfr, что приводит к увеличению количества фермента dhfr.

Концентрации МТХ составляют 50, 100 или 140 нМ на первом этапе и 1,5,10 или 25 мкмоль на втором этапе Суммарно отбирают примерно 150 стойких к МТХ клонов для продуцирования HBS Ag, при этом увеличение синтеза HBS Ag в значительной степени меняется от одного клона к другому как на первом, так и на втором этапе.

Число копий последовательности HBV на клетку в различных клонах опрделяют путем гибридизации целлюлозного фильтра согласно методике с использованием в качестве пробы клонированной HBV - ДНК, меченой г32р„ Для одинаковой дозы МТХ это число значительно меняется от одного клона к другому в пределах от 100 до 500.

, Последовательности HBV присутствуют в интегрированной форме,рефоре- тические профили для разных клонов в основном сопоставимы.

Количество специфических РНК последовательностей HBV анализируют путем молекулярной гибридизации, оно пропорционально скорости продуцирования HBS АЈ. Более того, для одинаковой дозы МТХ (50 нм) количество специфических РНК постоянно в различных анализируемых клонах. Выявлено два класса РНК. Один основной 2,1 т.п.о0 и другой неосновной 2,5 т.п.Оо Изучение этих РНК посредством карты S1 нуклеазы показывает наличие основного участка инициирования на пред-S в положении 3157, соответствующем РНК 2,1 т.п.о., и другого неосновного инициирования в промоторе SV 40, соответствующего РН 2,5 т.п.о,

П р и м е р 3, Анализ частиц HBS Ag

Анализ осуществляют на частицах, полученных 37БА5„ Поверхностные слои соответствующие нескольким сборам в стационарной фазе в течение 24 ч, соединяют вместе. Частицы HBS Ag очищают путем двух последовательных

5

0

5

100°С

ультрацентрифугирований в градиенте плотности CsCl с последующим скоростным ультрацентрифугированием ,в сахарозном градиенте. Частицы HBS Ag имеют плотность 1,20. В электронном микроскопе обнаруживают, что они представляют собой сферические частицы средним диаметром 22 нм, морфологически аналогичные частицам человеческого происхождения. Частиц трубчатой формы не обнаруживают.

После диссоциации частиц при

в течение 5 .мин в присутствии ДТТ полипептиды анализируют методом электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии SDS. Гель окра- пивают солями серебра. Наблюдают три полосы, соответствующие полипептидам 22 300, 26 100 и 34000 дальтон. Относительная интенсивность окрашивания этих трех полос позволяет определять пропорции трех белков, составляющие 54, 19 и 27%. После мечения 35 S метионином в условиях in vivo очищенные частицы подвергают иммуно- осаждению посредством анти-HBS сыворотки, а затем белки анализируют посредством электрофореза. На авторадиограмме обнаруживают три описанные полипептида в тех же пропорциях.

Наличие рецептора для pHSA на поверхности частиц обнаруживают методом радиоиммуноанализа в твердой фазе. Рецепторы обнаружены в поверхностном слое, а также на очищенных частицах.

П р и м е р 4. Определение иммунизации .

После ввода в препарат частиц гидрата окиси алюминия до концентрации 0,1% этот препарат используют для иммунизации мышей Balb/c. Иммунологическая сила клеточных частиц 5 идентична иммунологической силе вакцины от гепатита В, выпускаемого под торговой маркой HBV ACB (и получаемого из сыворотки людей - доноров с содержанием естественного HBS Ag). 0 50%-ная эффективная доза составляет 0,04 мкг для клеточных частиц и 0,03 мкг для HBVAC (торговая марка института Пастера).

Таким образом, вектор pSVS после интеграции в клеточную ДНК .позволяет осуществить синтез и выделение пустых оболочек вируса HBV в форме час- тиц 22 нм. Удаление большей части генома HBV и, в частности гена, кода0

5

0

5

рующего белок капсид, исключает продуцирование полностью инфекционных вирусных частиц. Этот вектор несет также звено транскрипции гена бурой водоросли dhfr, которое после ввода в dhfr обеспечивает их увеличение в присутствии МТХ за счет увеличения гена.

Синтез HBS Ag за счет блоков СНО является очень стабильным даже при отсутствии МТХ. И эта стабильность сохраняется в течение шести месяцев, что составляет примерно 300 генераций. В некоторых случаях наблюдается еще небольшое самопроизвольное увеличение продуцируемой HBS Ag

Кроме того, изобретение позволяет получить клоны, которые образуют им- муногенные частицы со значительной

генетической стабильностью, j

Частицы HBS Ag 22 мм, синтезированные клетками СНО, имеют такую же иммуногенность, как и HBV АСВ, который является препаратом частиц сывороточного происхождения. Скорости продуцирования HBS Ag сопоставимы со скоростями продуцирования при промышленном использовании. Присутствие pHSA рецептора на поверх0

5

0

5

0

ности этих частиц является дополнительным аргументом,для использования этой системы при получении вакцины против гепатита В„

Формула изобретения

Способ получения полипептида, обладающего иммуногенными свойствами HBS Ag,предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК со вставной части ДНК вируса гепатита Ё под контролем вирусного промотора, трансформацию полученной ДНК штаммов культивируемых клеток животного, отбор штаммов продуцентов, культивирование, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНКрЗУБ dhfr со вставкой Bglll фрагмента вируса гепатита В размером 23 кв под контролем раннего промотора SV 40, трансформируют полученной ДНК штамм СНО dhfr, а отбор штамма-продуцента осуществляют в присутствии МТХ в концентрации 50, 100, или 150 нмоль, затем в концентрации 5,10 или 20 ммоль и блот-гибридизацией с используемой в качестве ДНК - зонда НВК - ДНК, меченной 3ip.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения вакцин. Изобретение касается композиции, содержащей частицы, имеющие иммунологические свойства, характерные для антигена HBSAg. Эти частицы отличаются тем, что содержат также рецептор полимеризован- ного альбумина человека. Их получают путем трансформации человеческих или животных клеток вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую S- и пред-5-участки генома вирусного гепатита В, причем данная последовательность ДНК находится под контролем промотора, обеспечивающего эффективную транскрипцию данной последовательности в человеческие или животные клетки, трансформируемые данным вектором. (Л