Способ получения кДНК-клонов, кодирующих человеческий эритропоэтин Советский патент 1991 года по МПК C12N15/12 

Изобретение касается клонированных генов для человеческого эритро- поэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получение in vitro активного человеческого эритропоэтина (ЭПО).

Целью изобретения является повышение точности способа и повышение выхода эритропоэтина при экспрессии в животных клетках.

Способ заключается в том, что осуществляют отбор клонов в результате гибридизации кДНК-библиотеки фага мРНК фетальной печени с олигонук- леотидными зондами, которые получают путем выделения и очистки эритропоэтина из мочи людей, страдающих ап- ластической анемией с последующим анализом аминокислотных последовательностей трипсиновых фрагментов.

Пример 1. Выделение геномного клона ЭПО.

ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих анемией, известным способом за исключением того, что феноль- ную обработку заменяют термообработкой при 80 С в течение 5 мин для инактивации нейраминидаэы. Конечной стадией очистки является фракционирование на колонке высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием 0-95% ацетонитрильного градиента с 0,1%-ной трифторуксусной кислотой (ТФК) в течение 100 мин. Положение ЭПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом N- концевой последовательности основных пиков. ЭПО элюируют при 53% ацетонит- рила и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл, доводят до рН 7,0 бикарбонатом аммония, переваривают 2%-ным ТРСК-обработанным трип- сином в течение 18 ч при 37 С, затем подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой. Записывают оптическую плотность при 280 и 214 нм. Разделенные пики выпаривают почти досуха и подвергают не- посредственно анализу N-концевой аминокислотной последовательности, исползуя газофазный секвениатор. Два фрагмента из трипсинового гидролизата отбирают для синтеза олигонуклеотид- ных зондов. Из последовательности Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (аминокислоты 46-52) получают 17-мер

А А А TTCCANGCGTAGAAGTT

и 18-мер

А А А CCANGCGTAGTAG GAAGTTNAC.

Из последовательности Val-Tyr-Ser -Asn-Phe-Leu-Arg (аминокислоты 144- 150) получают два пула 14-меров

TTGN Т Т TTGN Т ТАСАСТААСТТССТ и TACACCTAACTTCTTf

которые отличаются в первом положении лейцинового клона.

Олигонуклеотиды 5 -конец метят по 32

Р, используя полинуклеотидную кина- зу и гамма 3гР-АТР. Геномную кДНК- библиотеку человека, клонированную в А бактериофаге, подвергают скринингу. Приблизительно 3,5 х 105 фага высевают с плотностью 6000 фага на 150 мм чашку Петри (среды NZCYM) и инкубируют при 37 С до тех пор, пока пятна не станут видимыми (размером около 0,5 мм). После охлаждения при 4еС в течение 1 ч реплики пятен пере носят на нейлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 37 °С на чашках со свежими средами. Затем филтры денатурируют и нейтрализуют. После вакуумной сушки при 80 С в тече- ние 2 ч фильтры промывают в 5 х SSC, 0,5% SDS в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют 4-8 ч при 48°С в ЗМ растворе тетраметиламмоний

, JQ 15

35

452930А

хлорида, Ю мМ , рН 6,8, 5 X раствор Денхарда, 0,5% SDS и 10 мМ ЭДТА. 17-мер, меченный Р, прибавляют в концентрации 0,1 пмоль/мл и гибридизируют при-48°С в течение 72 ч. После гибридизации фильтры промывают 2 SSC, 0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия, рН 7,0 при комнатной температуре, затем в течение 1 ч в ЗМ ТМАС1-10 мМ , рН 6,8 при комнатной температуре и 5-15 мин при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильных сигналов обнаруживают после 2-дневной авторадиографии. Эти клоны группируют в пулы по 8, пересеивают и вновь подвергают скринингу в трипликате.

П р и м е р 2. Анализ мРНК человеческой фетальной печени.

По 5 мкг мРНК человеческой фетальной печени и мРНК печени взрослого подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу. Одноните- вый зонд затем получают из матрицы М13. Праймером является 20-мер, происходящий из того же триптического фрагмента, что и первоначальный 17-мер- зонд. Зонд получают известным способом, однако вслед за отщеплением Smal (который продуцирует желательный зонд длиной 95 п.о., содержащий 74 п.о. кодирующей последовательности) малый фрагмент очищают от матрицы М13 хроматографией на колонке с се фазорой С14В. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 10 отсчетов в

20

25

30

0

5

0

5

1 мин этого зонда в течение 12 ч при 68°С, промывают в двух SSC при 68°Си подвергают воздействию в течение 6 дней усиливающего экрана. Фиксируют однонитевую маркерную мРНК из 1200 п.о.

П р и м е р 3. кДНК фетальной печени.

Идентичный зонд получают и используют для скрининга библиотеки кДНК фетальной печени, полученной в векторе Д -СН21А, используя стандартные методики скрининга. Три самостоятельных положительных клона CA-HEPOF L 6 (1350 пар оснований);ft-HEPOF L 8 (700 п.о.); ft-HEPOF L 13 (1400 и.о.)) выделяют путем скрининга 1 х 10е пятен. Полную вставку-Д-HEPOF L 13 и Д-НЕРОР L 6 секвенируют вслед за субклонированием в М13. Jv-HEPOF L 8 секвенируют только часть, а оставшуюся подразумевают идентичной другим клонам.

кДНК-клоны -HEPOF L б. Д-НЕРОР

L 8 и Д-НЕРОР L 13 депонированы в коллекции American Type Culture Collecti- on, Rockville, Maryland, под номерами АТСС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153 Соответственно.

Геномные клоны ft-НЕР01, t-HEP02, А-НЕРОЗ и А.-НЕРОб депонированы и доступны из American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящими номерами АТСС 40154, АТСС 40155, АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно.

i-и

,

6729306

Смесью трансформируют Е. coli, отбирают по устойчивости к тетрациклину и колонии подвергают скринингу с пользованием зонда, меченного по гибридизирующегося с фрагментом из 140 п.о. ДНК выделяют из положительно гибридизирующихся колоний и анализируют для отбора правильной ориен- Ю тации сайта Pvu II - на 5 -стороне вставки 140 п.о. Эта плазмида обозначена рТР L.

Фрагмент Ava II D вируса SV 40, содержащего последовательность энхан

Изобретение касается клонированных генов для человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получения INOITRO активного человеческого эритропоэтина (ЭПО). Целью изобретения является повышение точности способа и повышение выхода эритропоэтина. Способ получения клонов предлагает отбор клонов в результате гибридизации Л кДНК - библиотеки фага м РНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондами, которые получают путем выделения и очистки эритропоэтина из человеческой мочи, страдающих пластической анемией, с последующим анализом аминокислотных последовательностей трипсиновых фрагментов.

П р и м е р 4. Конструирование век-15 сера SV 40, получают путем гидролиза тора р9Ю23(В).ДНК SV 40 рестриктаэой Ava II, эатупВектором трансформации является pAdD 26 SVpA (3). Он содержит кДНК- ген дигидрофолятредуктазы мыши (DFHP который находится под транскрипци- ональным контролем основного позднег промотора аденовируса 2 (Ad 2). 5- сайт сращивания указан в аденовирусной ДНК, а З -сайт сращивания, происходящий от гена иммуноглобулина, присутствует между основным поздним промотором аденовируса 2 и DFHP-ко- дирующей последовательностью. Ранний сайт полиаденилирования SV40 присутствует по направлению ниже от DFHP- кодирующей последовательности. Участок прокариотического происхождения pAdD 26 SVpA исходит из pSVOd (Cell, 1981, 27, 279) и не содержит последовательности pBR 322.

pAdD 26 SVpA (3) превращают в пла миду pCVSV 12, padD 26 USpA (3) превращают в плазмиду pAdD 26 SVpA (3) (d; делецией одного из двух сайтов Pst в плазмиде PAdD 26 SVpA (3). Это осуществляют путем частичного переваривания рестриктазой Pst I так, что получают субпопуляцию линеаризованных плазмид, в которой только один сайт Pst I расщеплен. Затем обрабатывают ферментом Кленова, сшивают, скринируют для делеции сайта Pst I, расположенного 3 к полиаде- ниляционной последовательности SV 40

pAdD 26 SVpA (3) (d) расщепляют Pvu II. Затем -piAW 43 (Cell, 1979, 16, 851) переваривают Xho I, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают Pvu II, и фрагмент из 140 п.о. выделяют электрофорезом в 6%-ном акриламидном геле. Этот фрагмент 140 п. о. сшивают с Pvu II - переваренной плазмидой pAdD 26 SVpA (3) (d)

0

5

0

5

0

5

0

5

ления концов фрагментом Кленова, сшивания Xhol-лннкеров с фрагментами, переваривания Xho I для открывания сайта Xho I и выделения наибольшего фрагмента (D) посредством электрофореза в геле. Этот фрагмент затем сшивают с pTPL по сайту Xho I, получая плазмиду pCYS YL 2-TPL. Ориентация фрагмента Dsv 40 и pCYS YL 2-TPL такова, что поздний промотор вируса SV 40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса.

Для введения генов, связанных с аденовирусом (генов VA), в pCY SYL 2-TPL, вначале конструируют плазмиду pB R 322, которая содержит фрагмент В Hind III аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают Hind III и фрагмент В выделяют электрофорезом в геле, Этот фрагмент вставляют в плаэмиду pBR 322, которую предварительно расщепляют рестриктазой Hind III. После трансформации Е. coli отбирают рекомбинанты со вставкой фрагмента В Hind,III, и вставленную ориентацию определяют путем переваривания рестрикционным ферментом, pBR 322 - Hind III В содержит фрагмент В Hind III аденовируса типа 2 в ориентации. I

Гены VA получают из плазмиды pBR 322 - Ad Hind III В путем переваривания Нра I, добавления линкеров EcoR I и расщепления рестриктазой EcoR I с последующим восстановлением фрагмента 1,4 кб. Фрагмент, имеющий липкие концы EcoR I, затем встраивают по EcoR I в PTL. После трансформации НВ101 Е. coli и отбора по устойчивости к тетрациклину колонии подвергают скринингу посредством гибри716

специфичной к гену VA.

диэации с ДНК, ДНК получают из положительно гибри- диэирующих клонов и охарактеризовываю перевариванием рестрикционной эндону- клеазой. Полученную плазмиду обозначают р91023.

Два сайта EcoR I в плаэмиде р91023 отщепляют путем разрезания Р91023 ре- стриктазой EcoR I до двух ДНК-фрагментов: 7 т.п.о. и 1,3 т.п.о. Последний фрагмент содержит гены VA. Концы обоих фрагментов застраивают с использованием фрагмента Кленова Pol I и два фрагмента затем сшивают. Плазми- да р9Ю23(А). содержат гены VA и яв- ляется аналогичной плаэмиде р9Ю23, без EcoR I - EcoR I фрагмента.

Один Pst I-сайт в плазмиде р91023(А) отщепляют и заменяют на EcoR I-сайт. р91023(А) разрезают до готовности при помощи Pst I и обрабатывают фрагментом Кленова Pol I дл генерации прорастающих концов. EcoR I линкеры сшивают с тупоконечным сайтом Pst I плазмиды р91023(А). Линейную плазмиду р9Ю23(А) с EcoR 1-лин- керами, присоединенными по затупленному сайту Pst I, переваривают до готовности EcoR I, после чего повторно сшивают. Плазмиду р91023(В) восстанавливают и идентифицируют как структуру, аналогичную плаэмиде р91023(А) но вместо прежнего сайта Pst I содержащую сайт EcoR I. Плаз- мида р91023(В) депонирована в коллекции American Type Culture Collection Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39754.

ПримерЗ. кДНК-клоны (VEPOF L 6 и А-ЕРОР L 13 по примеру 3) встраивают в плазмиду р91023(В), образуя pPTF L 6 и pPTF L 13 соответ- ственно. 8 мкг каждой из очищенных ДНК используют для трансфекции 5МО клеток COS, используя DEAE-декстран- метод. Через 12 ч клетки промывают и обрабатывают хлорохином (О,1 мМ) в течение 2 ч, промывают вновь и выдерживают в течение 24 ч в 10 мл сред, содержащих 10%-ную фетальную телячью сыворотку. Среду меняют на 4 мл среды, свободной от сыворотки, и собирают через 48 ч.

Получение иммунологически активного ЭПО определяют количественно радиоиммунным анализом. Чувствительность пробы составляет 1 нг/мл. Уро

,б

8

5

0

5

вень ЭПО, высвобожденного в среду штаммом, содержащим pPTF L 13, составляет 330 нг/мл.

pPTF L 13 депонирована в коллекции American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39990.

Примерб. кДНК ЭПО (fl-HEPOF L 13) вставляют в плазмиду р9Ю23(В), трансфекцируют в клетки COS-1 и собирают аналогично примеру 5, за исключением того, что обработку хлорохином не проводят.

Биологически активный in vitro ЭПО измеряют с использованием либо коло- ниеобразующей пробы с клетками феталь- ной печени мыши в качестве источника CFV-E, либо пробы поглощения э.Н-ти- мидином, используя клетки.селезенки мышей, инъецированных фенилгидразином. Чувствительности этих анализов составляют 25 мЕд/мл. Биологически активный in vivo ЭПО измеряют с использованием либо метода гипоксической мыши, либо метода голодающей крысы. Чувствительность этих 100 мЕд/мл.

анализов составляет

30

25

ЭПО из клеток COS, трансфекциро- ванных кДНК-клона EPOF L 13 тип I:

5

5

0

5

0

5

Активность 100 нг/мл 2 0,5 Ед/мл 3,1 1,8 Ед/мл

1 Ед/мл

Проба

RIA

CFU-E

ЪH-Thy

Гипоксическая

мышь

Голодающая крыса2 Ед/мл

Пример 7. ЭПО из клеток COS.

180 нг ЭПО, высвобожденного в среду трансфекцированными кДНК-ЭПО (ft-HEPOF L 13) (выше), подвергают электрофорезу в 10%-ном SDS поли- акриламидном геле и переносят на нит- роцеллюлозный фильтр, зондируют антителом анти-ЭПО, промывают и повторно зондируют I белком А. Фильтр авто- радиографируют в течение двух дней. Нативный гомогенный ЭПО, описанный в примере 1, подвергают электрофорезу перед или после йодирования. Используемые, маркеры включают метио- нин,меченный, J5S, сывороточный альбумин (68000 Д) и яичный альбумин (45000 Д).

П Р RK1-4.

и м е р 8. Конструирование

Выделяют фрагмент Bam HI-Pvu II и плазмиды PSV 2D HFR, содержащий ранн промотор SV 40, смежный с геном ди- гидрофолятредуктазы мыши (DHFR), эн- хансер SV 40,малый антигенный интрон t и последовательность полиаденилиро вания SV 40 (фрагмент А). Остальные фрагменты получают из вектора р91023(А) (выше) следующим образом: р91023(А) переваривают Pst I в единственном сайте Pst I около промотора аденовируса и либо сшивают с синтетическими конвертерами Pst I-EcoR I и рециркулиэуют (создавая сайты Pst I- EcoR I-Pst I в первоначальном сайте Pst I; 91023(8)), либо обрабатывают большим фрагментом ДНК-полгмераэы I для разрушения сайтов Pst I и сшивают с синтетическим EcoR 1-линкером и рециркулизуют (создавая EcoR I- сайт в первоначальном сайте Pst I , 91023(В)). Каждую из двух полученных плазмид 9Ю23(В) и 91023(в ) переваривают ХЬа и EcoR I для получе- ния двух фрагментов (F и G). Путем соединения фрагмента G из плазмиды р9Ю23(В) и фрагмента F из плазмиды р91023(В ), а также фрагмента G из плазмиды р91023(В) и фрагмента F из плазмиды р9Ю23(В ) создают две новые плаэмиды,которые содержат либо сайт EcoR I-Pst I, либо сайт Pst I-EcoR I, где Pst I-сайт наиболее близок к основному позднему промо тору аденовируса (р9Ю23(С)).

Вектор р9Ю23(С)) гидролизуют Xho I липкие концы затупляют с помощью ДНК- полимеразы I, пришивают фрагмент Hind III-EcoR I размером 340 п.о., содержащий энхансер SV 40. Вектор с lac получают перевариванием ДНК с lac рестриктазой Bam HI, заполнением липкого конца фрагментом ДНК-полиме- разы I и перевариванием рестриктазой Hind III. Полученную плазмиду (cSVHPlac) регенерируют по Bam HI- сайту путем сшивания с тупым концом Pvu II. Фрагмент EcoR I-Hind III получают из SVHPlac и пришивают к фрагменту EcoR I-Hind III PSVOd, который содержит плазмидную основу репликации, и отбирают плазмиду pSVHPOd. Затем получают фрагмент Ec-oR I-Hind III из 340 п.о. плазмиды PSVHPOd, затуп- ляют с обоих концов ДНК-полимеразой I и сшивают с описанным Xho 1-перева- ренным, тупоконечным вектором

5

10

15

й 2025 30 -

7293010

р9Ю23(С). Полученную плазмиду, в которой ориентация фрагмента Hind 1II- EcoR I такова, что Вага HI-сайт внутри фрагмента является близлежащим к гену VA, называют pES 105. Плазмиду pES 105 переваривают Bam HI и Pvu II, а также отдельно Pvu II, и выделяют фрагмент Bam HI-Pvu II, содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Pvu II, содержащий ген устойчивости к тетрациклину, а также другие последовательности (фрагмент С). Фрагменты А, В и С сшивают и полученную плаэмиду выделяют и обозначают RK1-4. Плазми- да РК1-4 депонирована в коллекции America Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39940.

0 5 0

5

0

5

0

П р и м е р 9. Экспрессия ЭПО в клетках СНО (метод I).

20 мкг ДНК из плазмиды pPTF L 13, описанной по примеру 5, расщепляют эндонуклеаэой С1а I плазмиды и сшивают с С1а I фрагментом ДНК плазмиды pAdD 26 SVp(A)I (2 мкг), которая содержит интактный ген дигидрофоля- . тредуктазы (DHFR), приводимый в действие основным поздним промотором аденовируса. Эту ДНК используют для трансфекции DHFR - отрицательных клеток СНО и после двухдневного выращивания отбирают на альфа-средах, не имеющих нуклеотиды, и пополняют 10%-ной диализованной фетальной бычьей сывороткой. Вслед за ростом в течение двух недель в избирательных средах колонии извлекают, объединяют по группам из 10-100 колоний на пул, повторно высевают и выращивают до слияния в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды. Отстоявшиеся среды из пулов, выращенных до метотрексатной селекции, анализируют ЭПО посредством радиоиммуноанализа (RIA). Пулы, которые показывают наличие ЭПО, выращивают в присутствии метотрексата (МТХ) (0,02 мкМ), субклонируют и анализируют. С1а 44,02-7 пул высвобождает 460 нг/мл ЭПО в среду. Эта клеточная линия выбрана для получения ЭПО и депонирована в коллекции American Type Culture Collection под номером АТСС CRLI 8695.

Этот клон подвергают поэтапному отбору при возрастающих концентрациях И Х и обнаруживают даже более высокие уровни синтеза ЭПО.

На каждом этапе ЭПО измеряют в надосадочном слое культуры посредством RIA и биологической активности in vitro. Уровни используемого мето- трексата составляют 0,02, 0,1 и 0,5 мкМ, после первого цикла селекции при 0,02 мкМ МТХ в культуральные среды высвобождаются значительные уровни ЭПО.

Пример 10. Экспрессия ЭПО в клетках СНО.

ДНК клона ft-HEPOF L 13 переваривают EcoR I, и малый фрагмент RI, содержащий ген ЭПО, клонируют в EcoR сайт плазмиды R K1-4 (пример 9). Эту ДНК затем используют для трансфек- ции DHFR - отрицательных клеток СНО прямо (без переваривания), селекцию и амплификацию осуществляют, как описано.

ДНК PKF L 13 также встраивают в клетки СНО путем слияния протопластов и микроинъекции. Плазмида PKF L 13 депонирована в коллекции American Type Culture Collection, Rock- ville,Maryland под номером АТСС 39989.

Пример 11. Экспрессия клона ЭПО в клетках COS-1.

ДНК плазмиды pSVOD переваривают рестриктазой Hind III и затупляют ДНК-полимеразой I. ДНК клона ЭПО, /X-HEPOF, переваривают до готовности EcoR I и Hind III и фрагмент размером 4,0 т.п.о., содержащий ген ЭПО, выделяют и затупляют, как описано. Фрагмент гена ЭПО вставляют в плаз- мидный фрагмент pSVOd Плазмида CZ 2-1 имеет ген ЭПО в ориентации а (т.е. с 5 -концом ЭПО, самым ближайшим к началу SV 40), а плазмида CZ 1-3 находится в противоположной ориентации.

Плаэмиды CZ 1-3 и CZ 2-1 транс- фекцируют в клетки COS I по примеру

6, среды собирают и анализируют на иммунологически реактивный ЭПО. Приблизительно 31 нг/мл ЭПО обнаружено в культурах CZ 2-1 и 16-31 нг/мл - в культурах CZ 1-3.

Геномные клоны НЕР01, НЕР02 и НЕРОб могут быть вставлены в клетки COS для экспрессии аналогичным образом.

П р и м е р 12. Экспрессия в клет ках С127 и ЗТЗ.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

При конструировании рВРУЕРО плаз- миду SP6/5 переваривают рестриктазой EcoR I и соединяют с фрагментом | EcoR I (1340 п.о.) из -НЕРОГ L 13 при помощи ДНК-лигазы. Полученную плазмиду, в которой 5 -конец гена ЭПО является ближайшим к промотору SP6, обозначают pEP049F. В этой ориентации сайт Bam HI в полилинкере Р Рб/5 непосредственно примыкает к 5 -концу гена ЭПО.

Плазмиду pd ВРУ-MMTheo (342-12) переваривают Bam HI для получения двух фрагментов: большого фрагмента SjO т.п.о., содержащего геном ВРУ, и меньшего фрагмента, 6,5 т.п.о/, содержащего pML 2 начало репликации и ген ампициллин-устойчивости, ме- таллотионеинового промотора, ген нео- мицин-устойчивого и сигнал полиадени- лирования SV 40. Переваренную ДНК сшивают ДНК-лигазой и плазмиды, которые содержат только 6,8 т.п.о. фрагмент, идентифицируют перевариваниями рестрикционными эндонуклеазамн EcoR I и Bam HI. Плазмида обозначена рММТпеоВРУ. рЕР049 f переваривают Bam HI и Bgl II, и выделяют 700 п.о. фрагмент, содержащий целую ЭПО-коди- руклцую область. Bgl II-переваренную рММТЬеоВРУ и фрагмент Bam HI/Bgl II ЭПО (700 п.о.) сшивают, и идентифицируют гибридизацией в колониях при помощи оликонуклеотидного d (GGTCATCTGT-CCCCTGTCC) (зонда, являющегося специфичным к гену ЭПО). Плазмиду (рЕР015а), которая имеет кДНК ЭПО в ориентации так, что 5 -конец кДНК ЭПО является близлежащим к ме- таллотионеиновому промотору, идентифицируется путем переваривания EcoR I и Крп I.

Плазмиду pdBpy-MMTneo (342-12) переваривают Bam HI, выделяют фрагмент длиной 8,0 т.п.о., который содержит целый геном вируса бычьей папилломы, и сшивают его с Bam HI фрагментом, рЕР015а, идентифицируют плазмиду (рВРУ-ЭПО) гибридизацией в колониях с использованием олигонуклеотид- ного зонда d (P-CCACACCCGGTACACA-OH), который является специфичным к геному ВРУ. Плазмида pdBPy-MMTneo (342-12) депонирована в American Type Culture Collection, Rockville Maryland под номером АТСС 37224.

Методы I-III используются для экспрессии ЭПО.

Метод I. 25 мкг ДНК рВРУ-ЭПО используют для трансфекции 1х106 клеток С127 СНО, используя стандартные методики. Через 5 ч после трансфекции ере-, ды удаляют, клетки обрабатывают глицерином, промывают и прибавляют свежую L-среду, содержащую 10%-ную фе- тальную бычью сыворотку. Через 48 ч клетки трипсинизируют и расщепляют jg в соотношении 1:10 в DME среде, содержащей 500 мкг/мл G418, а клетки выращивают в течение 2-3 недель. G418 - устойчивые колонии, выделяют и выращивают в присутствии G418, за- 15 тем промывают, прибавляют свежие среды, содержащие 10%-ную фетальную бычью сыворотку, и среду собирают через 24 ч. Среды являются положительными для ЭПО при радиоиммунном анали д зе и биологической пробе in vitro.

Метод II „ Клетки С127 и ЗТЗ транс- фецируклч 25 мкг ДНК рВРУ-ЭПО и 2 мкг ДНК PSV 2 пео. Вслед за транс- фекцией применяют метод I.25

Метод III. Клетки С127 трансфеци- руют 30 мкг ДНК рВРУ-ЭПО по методу I. Вслед за трансфекцией и расщеплением (1:10) среды меняют каждые три дня. Приблизительно через 2 недели лоявля- зо ются очаги ВРУ-трансформированных клеток. Отдельные очаги собирают, выращивают до субсливающегося монослоя и анализируют на активность ЭРО или его антигенность в кондиционирован- ,д ных средах.

П р и м е р 13„ Экспрессия в клетках насекомыхо Конструирование EPOF L 13.

Плазмидный вектор депониро- Q ван в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39991.

переваривают EcoR I, затупляют с использованием большого фраг- д мента ДНК-полимеразы I, и одиночный линкер Not I

GGCGGCCGCC CCGCCGGCGG

сшивают с тупым концом. Полученную плазмиду обозначают N1.

рГУЕУ переваривают Smal и одиночный линкер Sfi I

GGGCCCCAGGGGCCC CCCGGGGTCCCCGGG

сшивают с тупым концом„ Полученную плазмиду обозначают р1УЕУ81„

Плазмиду р УЕУ81 переваривают Крп I и отщепляют от 0 до 100 п.о.

от каждого конца путем переваривания двунатриевой эндонуклеазой Bal 31. Полученные концы, которые не совсем тупые, затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы I, и полилинкер

ХЪа I

, g 5 д

5

о д

Q

0

тгО ЛKpn I

AGATCTCGAGAATTCTAGATGGATGGTACC TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG

сшивают с тупым концом. Полилинкер вставляют в обеих ориентациях. Плазмиду, в которой ориентирован полилинкер таким образом, что сайт Bgl II внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют IBg Kp. Плазмиду, в которой сайт Крп I внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному; генному промотору, называют р УЕУ81 KpBg. Число пар оснований, которые были потеряны между первоначальным Крп I-сайтом в р УЕУ81 и полиэдральным промотором, не опре- . делено. IBg Kp депонирована в American Type Culture Collection, Rockville, под входящим номером АТСС 39988.

N1 переваривают Крп I и Pst I. Большой фрагмент, который содержит начало репликации и 3 -конец полиэдрального гена, выделяют (фрагмент А). IBg Kp переваривают Pst I и Крп и меньший фрагмент, который содержит полиэдральный генный промотор и полилинкер, выделяют (фрагмент В). Фрагменты А и В объединяют ДНК-лигазой для образования новой плаэмиды IBg KpNe, которая содержит частично потерянный полиэдральный ген, в который вставлен полилинкер и Not I-сайт, который прикрырает фланг полиэдрального генного участка.

IBG Kp NI переваривают EcoR I и вставляют фрагмент EcoR I длиной 1340 п.о. из -НЕРОГ L 13. Плазмиды, содержащие ген ЭПО в ориентации так, что 5 -конец гена ЭПО является близлежащим к полиэдральному промотору и З1-концу полиэдрального , гена, идентифицируют путем переваривания Bgl II. Одну из этих плазмид обозначают как .

JKcnpeccHH ЭПО в клетках насекомых.

Плазмидную ДНК плазмиды выделяют и подвергают дальнейшей очист- ке CSCl-центрифугированием. ДНК-штамм L I вируса полиэдроза Autographa California дикого типа (AcNPY) получают фенольной экстракцией вирусных частиц и последующей очисткой вирус- ной ДНК.

Эти две ДНК трансфецируют в клетки IPL B-SF-21. Для каждой чашки тран фецируемых клеток используют хомутик ДНК AcNPY-дикого типа и 10 мкг pIYEPO Чагаки инкубируют при 27 С в течение 5 дней. Затем собирают надосадочную жидкость, и экспрессию ЭПО в надоса- дочном слое анализируют радиоиммунным анализом и биологической пробой in vitro.

Пример 14. Очистка ЭПО.

Среды клеток COS (121) с концентрациями ЭПО до 200 мкг/л концентрируют до 600 мл с использованием ультрафильтрационных мембран, диафильтруют против 4 мл 10 мМ раствора фосфата натрия, рН 7. Концентрированные и диа фильтрованные кондиционированные ере- ды содержат 2,5 мг ЭПО в 380 мг общего белка. Раствор ЭИО дополнительно концентрируют до 186 мл,,и .осажденные белки извлекают центрифугированием при 110000х g в течение 30 мин

рН надосадочного слоя, который содержит ЭПО (2 мг), доводят до рН 5,5. с помощью 50%-ной уксусной кислоты, перемешивают при 4°С в течение 30 мин и осадок извлекают центрифугированием при 13000х g в течение 30 мин.

Верхний слой (20 мл), содержащий 200 мкг ЭПО (24 мг общего белка), наносят на колонку с СМ-сефароэой (20 мл), уравновешенной в 10 мМ аце- тата натрия (рН 5,5), промывают 40 мл того же буфера. ЭПО, связанный с СМ-сефарозой, элюируют 100 мл градиента NaV (0-1) в 10 мМ растворе фосфата натрия (рН 5,5). Фракции, содержащие ЭПО (общее количество 50 мкг в 2 мг общих белков), объединяют по группам и концентрируют до 2 мл с использованием ультрафильтрационной мембраны.

Сконцентрированные фракции из СМ-сефарозы подвергают дальнейшей очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонку Vydac C-4.

5 Q

5

,

5

0

ЭПО подают на колонку, уравновешенную 10%-ным растворителем В (растворитель А представляет собой 0,1% в воде) растворитель В представляет собой 0,1% CFjCOzH в CF3CN), с низкой степенью подачи (1 мл/мин)„ Колонку промывают 10%-ным растворителем В в течение 10 мин и ЭПО элюируют линейным градиентом В (10-70%) в течение 60 мин. Фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группам (40 мкг ЭПО в 120 мкг общих белков) и лиофилиэируют. Лиофилизиро- ванный ЭПО повторно растворяют в 0,1 М растворе Tris-HCl (рН 7,5), содержащем 0,15 М Nad, и повторно хроматографируют ВЭЖХ с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группам и анализируют электрофорезом в SDS-полиакриламидном (10%) геле. Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5 мкг ЭПО в 25 мкг общего протеина.

Формула изобретения

Способ получения кДНК-клонов, кодирующих человеческий эритропоэтин, включающий отбор клонов в результате гибридизации библиотеки кДНК-клонов с маркированным радиоактивным фосфором зондом и последующее выявление целевых клонов, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа и выхода эритропоэтина при экспрессии в животных клетках, отбор клонов проводят в результате гибридизации ft кДНК-библиотеки бактериофага мРНК фетальной печени с оли- гонуклеотидными зондами

А А А А А А TTCCANGCGTAGAAGTT, CCANGCGTAGAAGTTNAC,

TTGN Т Т TTGN Т Т ТАСАССТААСТТССТ, ТАСАССТААСТТСТТ,

которые получают путем выделения и очистки эритропоэтина из мочи людей, страдающих апластической анемией, путем фракционирования жидкостной хроматографией высокого давления и элю- ирования с помощью 0-95%-ного градиента ацетонитрила и 0,1%-ной трифтор- уксусной кислоты, определения аминокислотной последовательности эритропоэтина в результате переваривания эритропоэтина трипсином при рН 7 и .температуре 37°С, выбора трипсиновых

17167293018

фрагментов Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-причем гибридизацию проводят при

-Lys- аминокислоты 46-52 или Val-Tyr-48°С в течение 3 дней, а выявление

-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg- аминокислотыцелевых клонов осуществляют с помощью

144-150 для синтеза олигонуклеотидов, ,авторадиографии.