Изобретение относится к активатору человеческого плазминогена и новому штамму бактерий, трансформированному плазмидой р :-рА1:гр12-продуценту активатора плазминогена тканевого типа.
П р и м е р 1 о Клетки меланомы че- ловека культивируют в 100 мл среды Игла, дополненной бикарбонатом натрия (конечная концентрация 0,12%), 2 мМ глютамина и 10% инактивирован- ной нагреванием сыворотки плода коровы. Клетки промывают один раз фосфатным буфером и прибавляют 0,3 мл среды, не содержащей сыворотки и мети онина. Добавляют 75 мкКи (353)-ме- тионина, инкубируют при 37°С в течение 3 ч, затем среду удаляют и обра- батывают или специфическим 1 gG активатором тканевого плазминогена или 1 преиммунной сывороткой для иммуноосаж- дения. Продукты иммуноосаждения подвергают электрофорезу в10%-ном SDS- акриламидном геле. Пластину геля фиксируют, сушат и подвергают флюорографии.
Из клеток меганомы экстрагируют РНТС. Клетки центрифугируют, повторно суспендируют в 10 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 1,5 мМ MgCl2, ли- зируют добавлением NP-40 (конечная концентрация 1%), а ядра осаждают центрифугированием. Надосадочный слой, содержащий всю РНК, очищают многократными экстракциями фенолом и хлороформом. Концентрацию соли в водной фазе доводят до 0,2 М NaCl. Осаждают РНК добавлением двух объеCft
сэ
1чЭ
СО
ел ю
CN
мов этанола и хроматографируют на оли ro-d Т-целлюлозе. Выход от 10 г культивированных клеток меланомы составляет 5-10 мг общей РНК и 50-200 мкг полиА мРНК.
ПолиА мРНК (200 мкг) фракционируют путем электрофореза через мочеви- ноагарозный гель: 1,75% агарозы, 0,025 М цитрата натрия (рН 3,8) и
6 М мочевины в течение 7 ч при 25 мА и 4°С. Гель разрезают лезвием. Индивидуальные тонкие слои в виде ломтиков расплавляют при 70°С и экстрагируют дважды фенолом и один раз хло- роформоМо РНК осаждают этанолом и последовательно испытывают трансляцией in vitro в системе лизата ретику Лоцитов кролика, дополненной микросомами поджелудочной железы собаки еле дующим образом. Проводят трансляцию, используя 25 мкКи (358)-метионина и 500 нг РНК из каждого тонкого слоя геля в 30 мкл среды, содержащей 25 мМ HEPES, 48,3 мМ хлористого калия, 10 мМ креатин фосфата, 19 аминокислот по 50 мМ каждой, 1,1 мМ хлористого магния, 16,6 мМ ЭДТА, 0,16 мМ дитиотрей- тола, 8,3 мМ гемина, 16,6 мг/мл креа- тинкиназы, 0,33 мМ хлористого кальция 0,66 мМ ЕДТА, 23,3 ИМ хлористого натрия . Инкубирование проводят при 30 С в течение 90 мин. Продукты трансляции или иммуноосажденные продукты трансляции анализируют с помощью электрофореза в 10%-ных полиакриламид ных гелях и додецилсульфате натрия. Пластинки гелей фиксируют, сушат и подвергают флюорографии.
„
Полученные в результате продукты трансляции из каждой гель-фракции им- муноосаждают. Наблюдается одна основная полоса иммуноосажденного полипептида, имеющая молекулярную массу приблизительно 63000 дальтон.
5 мкг фракционированной в геле мРНК используют для получения двутя- жевой кДНК с помощью стандартных процедур . Фракционируют кДНК по размеру и 6%-ном полиакриламидном геле. Элект роэлюируют кДНК размером больше чем 350 основных пар (125 нг). 30 нг кДНК с деокси(С)остатками трансформируют в 300 нг плазмиды pBR 322 с деокси(С)остатками по PstI участку. Смесь затем трансформируют в Е. coli Ј12 штамм 294 (АТСС-31446). Получают приблизительно 4600 трансформантов.
Q
5
.
5
Диализируют 2 мг образца активатора тканевого плазминогена против 0,01% Твина 80 в течение ночи при комнатной температуре. Затем растворяют лиофилизованный протеин в 12 мл 0,56 М трис-HCl буфера (,6), 8 М мочевины и 5 мМ ЭДТАо Восстанавливают дисульфидные связи добавлением О,1 мл В-меркаптоэтанола. Эту реакцию проводят в азоте в течение 2 ч при 45°Со Восстановленные дисульфиды алкилируют карбоксиметилпроизводным при добавлении 1,0 мл 1,4 М йодуксус- ной кислоты в 1 н. NaOH, через 20 мин реакцию останавливают диализом против Твина 80 и лиофилизу ют. Лиофилизованный карбоксиметилиро- ванный протеин снова растворяют в 3 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера (рН 7,5), прибавляют трипсин (ТРСК) в соотношении 1:50 и выдерживают при 37°Со Второе добавление трипсина проводят через 12ч. Через 24 ч наблюдается полное расщепление пептида.
0,5 мл образца наносят на колонку высокого разрешения Альтекс С-8 ультрасфера 5 мкм с двумя циклами. Устанавливают постепенный градиент ацето- нитрила (от 1 до 5% за 5 мин, от 5 до 35% за 10 мин, 35-50% за 30 мин). Элюент контролируют по двум длинам волн (210 и 280 нм).
После определения последовательности примерно 25 лучших возможных пептидных пика объединяют для получения предварительной модели первичной структуры активатора тканевого плазминогена,, Так получают несколько возмож ных зондов.
Индивидуально инокулируют колонии в отверстия пластин микротитратора, содержащие LB + 5 мкг/мл тетрациклина после добавления ДМСО до 7% и хранят при -20°С. Выращивают две копии фонда колоний на нитроцеллюлозных фильтрах и фиксируют ДНК каждой колонии на фильтре.
Готовят 32Р-меченый ТС/ /СА/ /ТА/т /ТСССА зонд из синтетического олиго- мера. Фильтры, содержащие 4600 трансформантов, предварительно гибридизуют в течение 2 ч при комнатной температуре в 50 мМ натрийфосфата (рН 6,8), 5XSSC, 150 мкг/мл обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 5х раствора Денхардта, Н)% формамида, а затем гибридизуют с 5к106 имп/мин меченого зонда. После инкубации в течение ночи
при комнатной температуре фильтры промывают 3 раза в 6xSSC, 0,1% SDS в течение 30 мин, один раз в 2xSSC, a затем экспонируют на рентгеновской пленке.
Выделяют плазмидную ДНК из всех колоний, показывающих положительную реакцию гибридизации. Определяют последовательности вставок кДНК этих клонов после субклонирования фрагментов в М13 векторе мр 7. Одна вставка кДНК в клоне 25Е10 имеет ДНК, кодирующую активатор тканевого плазми- ногена. Клон 25Е10 имеет 2304 пары оснований в длину и наиболее длинную структуру, кодирующую протеин из 508 аминокислот (Молекулярная масса 56756) и содержит 772 п.о.З нетранслируемой области„
50 мкг рРА25Е10 расщепляют рест- риктазой PstI и выделяют фрагмент 376 п.о. электрофорезом в 6%-ном полиакриламидном геле. 3 мкг этого фрагмента расщепляют рестриктазой
Ddel в течение 1 ч при 37 С, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. Полученные в результате Ddel липкие концы обрабатывают 5 единицами ДНК полимеразы I (фраг- мент Кленова)„ После экстракции фенолом и хлороформом ДНК расщепляют 15 единицами рестриктазы Narl в течение 2 ч и подвергают электрофорезу в 6%-ном полиакриламидном геле. Извлекают приблизительно 0,5 мкг фрагмента размером 125 п.о. с тупым концом Narl. Этот фрагмент кодирует аминокислоты с номера от 69 до 110 зрелого протеина активатора тканевого плазминогена полной длины.
30 мкг рРА25Е10 расщепляют 30 единицами Narl и 35 единицами Bglll в течение 2 ч при 37°С и подвергают реакционную смесь электрофорезу в
6%-ном полиакриламидном геле. Выделяют приблизительно 6 мкг 1645 и.о. Narl-Bglll фрагмента.
Плазмида рае Ita RISRC является производной плазмиды psR Cex 16, в которой Eco RI участки, проксимальные к trp промотору и дистальные к SRC гену, удаляют репарацией ДНК по- лимеразой I и встраивают самокомплементарный олигонуклеотид AATTATGAATTCAT, синтезированный по фосфотриэфирному методу. 20 мкг этой плазмиды расщепляют EroRI, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают эта
5 0
5
0
5
0
5
0
нолом. Затем плазмиду разрезают 100 единицами нуклеазы SI при 16°С в течение 30 мин в 25 мМ ацетата натрия (рН 4,6), 1 мМ ZnCl2 и 0,3 М NaCl для создания тупого конца с последовательностью АТС. После экстракции фенолом и хлороформом и осаждения этанолом ДНК рестрицируют BamHI, проводят электрофорез в 6%-ном полиакриламидном геле и извлекают большой (4300 п.о.) фрагмент вектора.
Экспрессионную плазмиду собирают соединением 0,2 мкг вектора, 0,06 мкг фрагмента 125 п.о. с тупым концом Narl и 0,6 мкг фрагмента 1645 п.о. Nar-Bglll с 10 единицами Т4 ДНК ли- газы в течение 7 ч при комнатной температуре и трансформируют в E.coli штамм 294 (АТСС № 31446).
Плазмидную ДНК из 26 колоний выделяют и расщепляют рестриктазами Xbal и EcoRI.12 из этих плазмид содержат фрагменты 415 п.о. Xbal-EcoRI и 472 п.о. EcoRI. Анализ последователь ности ДНК подтверждает, что некоторые из этих плазмид имеют АТС, начальный кодон, правильно расположенный в начале аминокислоты номер 69 (серии), Одна из этих плазмид - продуцирует активатор тканевого плазминогена.
3 мкг ДНК лимфоцитов человека полностью расщепляют различными эндо- нуклеазами, проводят электрофорез в 1,0%-ных агарозных гелях и переносят на нитроцеллюггозный фильтр. Готовят Р-меченую ДНК в виде зонда из вставки 5 конца кДНК клона рРА25Е10 (фрагмент 230 п.о. Hpall-RSAl) и гиб- ридизуют с нитроцеллюлозным фильтром в течение 40 ч, затем фильтр промывают. Полученные данные свидетельствуют о наличии одного гена активатора тканевого плазминогена в человеческом геноме.
Реконструкция полной кодирующей последовательности возможна с примене нием обычного Hhal участка рестрик- ционной эндонуклеазы, разделенного на два частичных клона рРА17 и РА25Е10. Из плазмиды рРА17 выделяют рестрик- ционный фрагмент 55 п.о. Sau 3AI- Hhal, соответствующий аминокислотам 5-23. Из плазмиды рРА25Е10 выделяют фрагмент 263 п.о. Hhal-Narl (кодирующий аминокислоты 24-110). Конструируют два синтетических деоксиолигонукле отида, которые реконструируют кодоны
ля аминокислот 1-4, включают кодон нициирования трансляции АТС и создают EroRI липкое окончание,, Эти три фрагмента затем связывают вместе с образованием 338 п.о. фрагмента, коирующего аминокислоты 1-110. Этот фрагмент и фрагмент 1645 п.о. Narl- Bglll из рРА25Е10 затем связывают по EcoRI и Bglll участкам плазмиды pLelPAtr р 103 для получения плазмиды экспрессии pt-PAtrp12.
Выращивают E.coli K12 штаммW3110 (АТСС № 27325), содержащий плазмиду pt-PAtrp12,, и готовят экстракты для проб на фибринолитическую активность. Количество образовавшегося плазмина определяют измерением степени расщепления фибрина на агарозной пластине, содержащей плазминоген и фибрин. Плаз- мин дает четкую зону лизиса на фибри- новой пластине и площадь этой зоны коррелируют с количеством активатора тканевого плазминогена в образце. При испытании экстрактов из pt-PA trp12 клонов на активность активатора тканевого плазминогена используют пробы с фибриновой пластиной с образованием четкой зоны лизиса. Эта фиб- ринолитическая активность ингибирует- ся анти-т-АП IgG, но не преиммунизи- руется IgG или антиурокиназа IgG. Экстракт, полученный из клеток, содержащих в качестве контроля лейко- цитно-интерферонную плазмиду pLelFtrp 103, не показывает активности. Получают приблизительно 20 единиц экстрагированной активности на 10 клеток (для очищенного т-АЛ 90000 единиц Плуга 1 мг)„
Полученный штамм бактерий E.coli АТС С31446 характеризуется следующими свойствами.
Имеет гепотип endA, Thi, hsr, hsmЈ.
Растет в среде LB (10 г бактотрип- 5 г бактодрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия на литр среды).
Для хранения на 3 мл LB ночной культуры добавляют 2 мл 50%-ного глицерина, размешивают и замораживают в стерилизованных бутылочках при -20°С. П р и м е р 2. Колонию E.coli, содержащую плазмиду puRIPA0, выращивают в 5 мл среды роста LB, содержащей 20 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 37 °С. Аликвоту этой культуры разбавляют 1:100 в 300 мл М9 среды, содержащей 20 мкг/мл ампициллина, и
5
0
5
0
5
0
5
0
5
выращивают при 37°С в течение 4 ч до плотности ОЕ550 0,419. Добавляют триптофановый аналог индолакриловой кислоты до концентрации 30 мкг/мл. Инкубируют клетки 90 мин до плотности ОБ sso - 0,628. Клетки центрифугируют и повторно суспендируют в 0,8 мл 0,01 М трис-буфера (рН 8,0), содержащего 0,01М ЭДТА. Полученную суспензию интенсивно перемешивают 18 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугируют и проверяют надосадочный слой на активность активатора тканевого плазминогена.
В табл.1 и 2 приведены результаты, полученные при активации плазминогена соответствующими экстрактами E.coli.
Генерируемая активность зависит от наличия плазминогена (табл.1). Эта активность не вызывается предим- мунной сывороткой кролика, но она четко ингибируется антисывороткой, которая была получена против активатора тканевого плазминогена, происходящего из очищенных клеток меланомы (табл.1 и 2). Это показывает, что экстракты E.coli дают активность по активации плазминогена, которая ингибируется антителами против активатора тканевого плазминогена.
П р и м е р 3. Продуцирование т-АП с использованием ДГФР протеина с низким связывающим сродством к МТТ.
Последовательность, кодирующую активатор тканевого плазминогена (ттАП) встраивают в плазмиду, содержащую мутантную ДГФР с низким связывающим сродством к МТТ. Для этого три фрагмента из частично перекрывающихся т-АП штазмид, рРА25Е10 и рРА17, и PURIPA (выше) получают следующим Образом.
Расщепляют плазмиду рРА17 рестрик- тазой Ddel, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимераэы I, расщепляют рестриктазой PstI, выделяют фрагмент размером приблизительно 200 п.о., содержащий 5 терминальную последовательность т-АП. Получают второй т-АП фрагмент расщеплением puRIPA с помощью PstI и Narl, выделяют фрагмент размером 310 п.о. Третий т-АП фрагмент получают расщеплением рРА25Е10 с помощью Narl и Bglll и выделяют фрагмент размером 1645 п.о., который, кроме того, содержит большую часть кодирующей области т-АП и некоторое
количество З7нетранслируемых последовательностей.
Плазмиду рЕ342, которая экспресси- рует НВУ поверхностный антиген, расщепляют с помощью Hindlll, превращают Hindlll концы 4 в EcoRI концы путем добавления конвертера (AGCTGATTC). Эту ДНК разрезают PvuII и добавляют RI связки. Последующее расщепление EcoRI приводит к выделению фрагмента 348 п.о его клонируют в pBR322. Конструируют плазмиду экспрессии рН ER 348-Е путем клонирования фрагмента 1986 п.о. полученного в результате гидролиза HBV с помощью EcoRI и Bglll, затем линеаризуют pRI-Bgl и EcoRI и вводят фрагмент 348 п.о., представляющий собой исходную область SV 40, a EcoRI участок pRI-Bgl модифицируют рЕ342 частичным гидролизом EcoRI, заполняя отщепленный участок с использованием фрагмента Кленова ДНК полимеразы I и связывая затем части плазмиды.. Полученную в результате плазмиду pE342URI гидролизованную EcoRI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы I и расщепляют BamHI. Путем электрофореза в акриламидном геле получают фрагмент размером 3500 п.о., экстрагиру- ют его фенолом и хлороформом, осаждают этанолом.
Полученный таким образом вектор р342Е 3500 п.о. связывают с т-АП фрагментами размером около 2160 п.о., используя стандартные методики. Вы- деляют плазмиду, содержащую три т-АП кодирующих фрагмента в нужной ориентации, характеризуют и вырезают рЕ342-т-АП. Эту плазмиду гидролизу- ют SacII и обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой (BRL). Для обеспечения ДГФР последовательности выделяют фрагмент приблизительно 1700 п.о гидролизом SacII pEHeR (pEHeR является плазмидой, экспрессирующей мутант ДГФР). Этот фрагмент встраивают в рЕ342-т-АП плазмиду для создания pEdPAER 400 плазмиды, которая является аналогичной pEHER за исключением того, что HBS Ag кодирующая область заменена кДНК последовательностями от т-АП.
Проводят трансфекцию рЕТРАЕ 400 XpETPER) в dhfr-CHO ДИХ В11 клетки и ДГФР+СНО К1 (АТСС CCL 61) клетки. Отбирают трансформированные dhfr клетки путем выращивания на среде, лишенной глицина, гипоксантина и ти
0
0
5 ,.
5
0
5
0
5
мидина. Отбирают трансформированные ДГФР клетки выращиванием в 100 мМ МТТ. Колонии, которые возникают на соответствующей селекционной среде, выделяют,, используя клонирующие циклы, и размножают на той же среде до нескольких генераций.
Для амплификации клетки колоний
г
выращивают в среде, содержащей 5 10 10Г, 2,5 10s , 5-Ю5 и 106 нМ МТТ.
ДНК амплифицированных колоний выделяют следующим образом. Промывают монослои в 150 мм пластинах 50 мл стерильного pBS и лизируют добавлением 5 мл 0,1%-ного SDS, 0,4 М СаС1А, 0,1 М ЭДТА (рН 8), через 5-10 мин экстрагируют фенолом, затем хлорофор-1 мом и осаждают этанолом. Осадок ДНК суспендируют в 1 мл (на 150 мм пластине) 10 мМ трис/HCl, рК 8,1 мМ ЭДТА (ТЕ), добавляют ГНК-азу до 0,1 мг/мл и инкубируют 30 мин при 37°С.
Затем прибавляют SDS до О,1%s про- назу до 0,5 мг/мл, инкубируют 3-16 ч при 37°С, экстрагируют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом. Осадок ДНК суспендируют в 0,5 мл воды, гидролиз уют рестрикционными ферментами и подвергают электрофорезу в 1%-ном агарозном геле, затем гель извлекают и окрашивают. После визуализации в ультрафиолетовом свете ДНК переносят на нитроцеллюлозные фильтры, фильтры гибридизуют меченым SacII фрагментом ДНК размером 1700 п.о. плазмиды pEHER или Bglll фрагментом ДНК размером 1970 п.о, плазмиды PETPER.
Для трансфекции лишенных ДГФР клеток используют плазмиду pETPFR. Испытывают 21 колонию, которые выращивают на селективной среде (-ГТТ), детекцией на образование плазмина. Обнаруживают четыре клона, имеющих одинаковую или сравнимую т-АП секрецию.
Указанные субклоны в количестве 2-10 клеток помещают на пластины 100 мм в 50 нМ МТТ, еще раз селекционируют, отбирают два клона для дальнейшего исследования и называют их
1-15 и 18В-9.
Субклоны 1-15 и 18В-9 после выдерживания примерно в течение 1-2 мес. испытывают,Для этого серийно разбавляют очищенный т-АП и очищенный меченый йодом т-АП, происходящие из клеток меланомы, до концентрации от 12,5 до 400 мг/мл в буфере, содержатем забуферированный фосфатом солевой раствор (рН 7,3), 0,5% сыворотки бычьего альбумина, 0,01% Твина-80 и 0,02% NaNq. Образцы с соответствующими разбавлениями среды прибавляют к радиоактивно меченым белкам, инку« бируют в течение ночи при комнатной температуре в присутствии IgG фракции анти-т-АП антисыворотки кролика. Осаждают комплекс антиген - антитело путем абсорбции кеа-анти-кролик IgG иммунобусинок (Вио Рад) в течение 2 ч при комнатной температуре. Шарики отмывают и измеряют радиоактивность, осадков. Определяют концентра ции путем сравнения с внутренним стандартомо
Амплифицированная культура продуцирует до 50 пг на клетку в 1 день, т-АП. Формула изобретения
Штамм бактерий Escherichia coli АТСС 31446 (pt-pA)trp12 - продуцент активатора плазминогена тканевого типа.
Таблица 1
Активация плазминогена экстрактам из E.coli культур, содержащих P&RIPA
Продолжение табл.1
Процент активности вычислен вычитанием холостого опыта (0,043) из полученных величин и делением на полученную величину экстракта.
Таблица2
Плазминогенная активация экстрактов EoColi культур pt-PAtrp12
30
Экстракт
0,657
(100)
Изобретение относится к активатору человеческого плазминогена и новому штамму бактерий, трансформированному плазмидой PT - PATRP12 - продуценту активатора плазминогена тканевого типа. С помощью генно-инженерных приемов конструируют плазмиду PT - PATRP12, кодирующую 1 - 110 аминокислоты плазминогена. Полученной плазмидой трансформируют штамм E.COLI К12, путем многократного пересева отбирают клон, синтезирующий до 50 пг на 1 клетку в 1 день активатора тканевого плазминогена.
Экстракт (без плазминогена)
0,043 (0)
Экстракт плюс пред- иммунная сыворотка
Экстракт плюс анти- т-АП антитела
0,665
0,059
101
| Устройство для сухой перегонки бересты | 1932 |
|
SU37687A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
