Способ выделения пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба CeRReNa махIма MURR Советский патент 1991 года по МПК C12N9/08 

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, которые

могут быть использованы для аналитических целей особенно в микробиологической промышленности, в медицине для осуществления иммунопероксидаз- ного метода гистологических исследований, проводимых в целях диагностики.

Целью изобретения является повышение удельной активности, чистоты препарата пероксидазы и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента.

Способ заключается в том, что в предлагаемом способе выделение пероксидазы из культурального фильтрата (КФ) базидиального гриба Cerrena maxima Murr используют волокнистый сорбент из альгинатного волокна с содержанием альдегидных групп глутарово- го альдегида 0,85-0,90 мас.% и альбумина 11-13 мг/г волокна. Волокнистый сорбент с указанным содержанием альдегидных групп глутарового альдегида и альбумина обеспечивает согласно способу возможность получения пероксидазы с удельной активностью 68,3 ед/мг белка, чистотой ,87, термостабильностью при инкубации в течение 10 мин при 80°С 97% и при 90°С 78% от исходной активности с сохранением суммарной активности по сравнению с исходной 81,1%.

При меры 1-12. Альгинатные волокна сформованьь из 9Ј-ного водного раствора альгината натрия с рН 6 в осадительную ванну, содержащую 5% хлористого кальция и 3 ммоль/л соляной кислоты,

Температура приготовления прядильного раствора 60 С, температура формования 30°С, температура осадитель- ной и пластификационной ванн 20 С. Скорость формования 2,5 м/мин, величины фильеркой и пластификационной вытяжек 140 и 85% соответственно. Пла- стификационное вытягивание проводят в среде изопропилового спирта, Альгинатные волокна имеют абсолютную разрывную нагрузку 14,8 сН, относительное разрывное удлинение 19,7%.

Альгинатное волбкно массой 10 г, модифицированное глутановым альдегидом с содержанием альдегидных групп 0,80 мас.% обрабатывают раствором альбумина с концентрацией 1 мг/мп при 18+2°С в течение 60 мин. Подучают волокно с содержанием 9 мг/г ковалент- но присоединенного альбумина. Продукт промывают дистиллированной водой и обрабатывают JOOO мл КФ базидиалъно-

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

го гриба Cerrena max ma Murr в течение 20 мин при . Затем волокно отделяют от жидкой фазы и промывают дистиллированной водой до отсутствия в промывных водах белка. Разрушение комплекса альбумин-пероксидаза осуществляют 500 мл 0,2 М уксусно-аце- татного буфера в течение 10 мин при 18нн2°С. Раствор белка в указанном буфере подвергают диализу против воды в течение 24 ч и лиофильной сушке. В полученном препарате определяют пе- . роксидазную активность по скорости расщепления пероксида водорода с применением о-дианизидина как донора водорода, которую измеряют по изменению скорости развития окраски при 460 нм. Содержание белка определяют по изменению окраски красителя Coomassic Blue, Термостабильность устанавливают путем инкубации испытуемого образца в 0,01 М ацетатном буфере при 80 и 90°С в течение 10 мин. Активность выделенной пероксидазы составляет 63,5% от исходной, удельная активность 50,7 ед./мг, чистота фермента ,63, термостабильность, характеризуемая сохранением активности препарата фермента, при 80°С, составляет 81%, при 90°С - 53%.

Характеристика пероксидазы, выделенной из КФ Cerrena maxima rturr селективными сорбентами волокнистой структуры, с различным содержанием альдегидных групп и альбумина приведена в табл. 1.

Анализ данных табл. 1 показывает, что уменьшение содержания альдегидных групп (менее 0,80 мас.%) невозможно, так как альгинатное волокно набухает и разрушается в процессе о десорбции уксусно-ацетатным буфером, о чем свидетельствует изменение усадки волокна от 2,5% при содержании альдегидных групп 0,77 мас.% (пример 3) до 5,4% при содержании альдегидных групп 0,87 мас.% и выше (примеры 6-12). Увеличение содержа- ния альбумина в волокне влечет за собой повышение выхода пероксидазы от 63,5 до 81,1% от начального содержания по активности в КФ. Увеличить содержание альбумина в альгинатном волокне (более 13 мг/г) экспериментально не удалось.

Удельная активность также возрас- тает от 50,7 (пример 6) до 68,3 ед./ /мг (пример 12) при увеличении чис- ,

тоты препарата, характеризуемой пока- зателем R, который возрастает в указанном ряду от 0,63 до 0,87. Термостабильность выделенного препарата пероксидазы повышается с увеличением его чистоты.

Учитывая это, оптимальное количество альдегидных групп в структуре альгинатного волокна составляет 0,85- 0,90 мас.%, а содержание альбумина 11-13 мг/г сухого сорбента.

Результаты сорбции и десорбции окислительно-восстановительного фермента пероксидазы приведены в табл. 2.

Анализ данных табл. 2 показывает, что использование предлагаемого споХарактеристика прочностных свойс модифицированного альгинаторного во локна изменяется несущественно, что позволяет рекомендовать его для лр ведения регенерации. Последнюю осущ ствляют путем обработки волокна 0,1 М НС1 и альбумином. После реге нерации работоспособность волокна п отношению к пероксидазе восстанавли вается. Физико-механические .войств альгинатного волокна позволяют пров .„ дить три цикла регенерации (табл. 4 Из данных табл. 4 видно, что в четв том цикле регенерации абсолютная ра рывная нагрузка и относительное удли нение уменьшаются, вследствие этого

соба по сравнению с известным позволяет получить препарат с удельной актив- 20 волокно теряет способность к формо- ностью 68,3 ед./мг, что в 2,2 раза вы- устойчивости.

ше, чем по известному способу, причем выход фермента по активности не снижается и составляет 81,1%, при этом термостабильность пероксидазы значительно возрастает в сравнении с известным способом.

Пример 13, Аффинный сорбент может быть использован многократно. Результаты исследования альгинатного волокна, модифицированного глутаровым альдегидом и альбумином в нескольких циклах сорбции и десорбции окислительно-восстановительного, фермента пероксидазы из КФ Cerrena maxima Мигг приведены в табл. 3. i

Анализ Данных табл. 3 показывает, что использование указанного волокна в нескольких циклах сорбции-десорбции снижает выход препарата пероксидазы от цикла к циклу. Хотя свойства выделенной пероксидазы изменяются не- зцачительно, использбвание сорбента более чем в 7 циклах работы нецелесообразно с экономической точки зрения„

так как выход препарата значительно снижается.

Характеристика прочностных свойств модифицированного альгинаторного волокна изменяется несущественно, что позволяет рекомендовать его для лро- ведения регенерации. Последнюю осуществляют путем обработки волокна 0,1 М НС1 и альбумином. После регенерации работоспособность волокна по отношению к пероксидазе восстанавливается. Физико-механические .войства альгинатного волокна позволяют прово- „ дить три цикла регенерации (табл. 4). Из данных табл. 4 видно, что в четвертом цикле регенерации абсолютная разрывная нагрузка и относительное удлинение уменьшаются, вследствие этого

0 волокно теряет способность к формо- устойчивости.

Учитывая возможность регенерации, альгинатное волокно, модифицированное глутаровым альдегидом и альбумином можно использовать в циклах сорбции пероксидазы из КФ Cerrena maxima Murr.

Формула изобретения

Способ выделения пероксидазы из культурального фильтрата базидиаль- ного гриба Cerrena maxima Murr, включающий взаимодействие культурального фильтрата с волокнистым сорбентом с последующей десорбцией фермента ук- сусно-ацетаткым буфером, отличающий с я тем, что, с целью повышения удельной активности, чистоты препарата пероксчдазы и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента, в качестве волокнистого сорбента используют альгннат- ное волокно, содержащее О, 85-0690 мас.% альдегидных групп глутарового альдегида и 10-13 мг альбумина на 1 г сухого сорбента,

ON N J3

U

ON

альвоумин

II

282

20

7,1

500

6,7

68,3

4,8

0,87

232

81,1

10

97

78

ТаблицаЗ

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, котомогут быть использованы для аналитических целей в микробиологической промышленности, в медицине для осуществления иммунопероксидазного метода гистологических исследований, проводимых в целях диагностики, Целью изобретения является повышение удельной активности пероксидазы, чистоты препарата и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента. Способ заключается в том, что выделение пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба Cerrena maxima Murr проводят с использованием аффинного сорбента на основе альгинатного волокна, содержащего в своей структуре альбумин, ковалент- но связанный глутаровым альдегидом. Обратимое взаимодействие пероксидазы с аффинным лигандом альбумином обеспечивает строгую специфичность по от- ношению к ферменту, Комплекс альбумин - пероксидаза разрушается в процессе десорбции 0,2 М уксусно-ацетат- ным буфером рН 4,7, причем перокси- даэа переходит в раствор, а селективный сорбент остается работоспособным для следующего цикла сорбции-десорбции. Применение нового селективного сорбента позволяет получить пе- роксидазу из культурального фильтрата с высокой удельной активностью

Примечание. Содержание альдегидных групп в волокне 0,90 мас.%,

содержание альбумина 13 мг/г.

Цикл

Абсолютная разрывная нагрузка, сН

12,5

10,9

9,5

8,7

ТаблицаА

Относительное удлинение, %

17,5 16,9 16,1 15,0