Способ определения численности углеводородокисляющих бактерий Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/06 C12N1/20 

Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано для бактериологического анализа природных сточных вод и особенно донных отложений.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ заключается в следующем,

Готовят ряд последовательных разведений пробы грунта 10 10 Если анализу подвергают воду, то к разведению пробы можно не прибегать. Из каждого разведения отфильтровывают определенный объем воды через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2- 0,3 мкм. Фильтры предварительно кипятят Б дистиллированной воде до 10 раз и стерилизуют в автоклаве при 1,2 атм

в течение 40 мин. Перед фильтрованием разведений новой пробы Зейтца воронку протирают тампоном, смоченным спиртом, и обжигают в пламени горелки. Фильтровать начинают с максимального разведения, после чего обработку воронки спиртом для последующих разведений не производят.

Фильтры фильтрующей поверхностью погружают на 2-3 с в капельки стерильной нефти, нанесенные на дно чашки Петри. Для каждого фильтра желательно использовать отдельную каплю нефти. Далее их переносят на пористую поверхность подложки, в качестве которой можно применять поролон. Подложки толщиной 5 мм подготавливают к работе аналогично фильтрам (кипятят

316293

до 10 раз и стерилизуют при 1,2 атм : в течение 40 мин), после чего помещают на дно стерильной чашки Петри, в которую заливают чинераг:ьную среду, , например среду Диановой-Ворошиловой, В одной чашке можно расположить до 3-4 подложек и, соответственно, фильтров.

Посевы инкубируют при 21°С. Учет ю выросших колоний производят под микроскопом при увеличении 120 раз (8х XI, ) в 10 полях зрения с последующим пересчетом на 1 мл исходной гфобы. Колонии контрастно выделяются 15 на фоне нефтепродукта, что позволяет избегать окрашивания фильтра эрит- розином, сохраняя живыми культуры микроорганизмов.

Расчет численности углеводород- 20 окисляющих бактерий проводят при подсчете колоний на всех фильтрах, усредняя полученные значения, либо по одному из фильтров при сливном росте или, наоборот, низкой концентрации 25 колоний на других фильтрах.

Появление колоний на фильтре отмечается через 2-3 сут,Учет колоний на фильтрах в процессе инкубирования приведен в табли-до це.

Бактерии, которые в естественной среде адаптированы к использованию углеводородов в качестве субстрата, т.е. имеющие соответствующую фермент- с ную систему, опережают по темпам роста бактерии, вынужденные синтезировать соответствующую ферментную систему. Активные углеводородокисляющие бактерии формируют колонии через 2- до 3 сут, тогда как бактерии, потенциально способные утилизировать углеводороды, завершают формирование ко- лоний через 5-6 сут.

Пример. 1 мл пробы воды про- фильтровывают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2-0,3 мкм. Фильтр предварительно кипятят в дистиллированной воде и стерилизуют в автоклаве при 1,2 атм в течение 40 мин,-0

После окончания фильтрования пробы мембранный фильтр фильтрующей поверхностью погружают на Z-3 с в ка184

пельку стерильной нефти, нанесенную i на дно чашки Петри. Далее фильтр переносят на пористую поверхность подложки толщиной 5 мм, в качестве которой используют поролон. Подложку, подготовленную так же, как и фильтр, помещают на дно чашки Петри, в которую заливают минеральную среду следующего состава, г/л: KNO 2,0; КНгРОф 0,6; NaЈHP04 12НгО 1,4} MgS04-7H20 0,8; Мп504«4Н О 0,1, FeS04 7Н20 еле- ды, вода водопроводная, рН 6,9-7,2,

Чашки Петри инкубируют при 21°С, Выросшие на фильтре микроколонии подсчитывают под микроскопом при увеличении 120 раз в 10 полях зрения с последующим пересчетом на 1 мл исходной пробы. .

После 2 сут инкубирования количество выросших микроколоний на фильтре соответствует 7,110 клеток/мл, после 6 сут. - 59,1 «10 б.

Предлагаемый способ позволяет проводить учет численности активной и потенциальной углеводород-окисляклцей микрофлоры, при этом сохраняется жизнеспособность культур микроорганизмов вследствие контрастирования колоний на фильтре углеводородным субстратом, а не химическим красителем.

Формула изобретения

Способ определения численности углевод ородокисляющих бактерий, предусматривающий фильтрацию через мембранный фильтр пробы воды или разведений водной вытяжки из грунта, размещение фильтра на увлажненной пористой подложке, инкубирование и учет выросших микроколоний под микроскопом через определенное время, отлич ающи й- с я тем, что, с целью повышения точности способа, подложку предварительно увлажняют минеральной средой, а на фильтрующую поверхность фильтра наносят тонкий слой углеводородного субстрата, при этом после 2-3 суток инкубирования проводят учет бактерий, активно окисляющих углеводороды, а после 5-6 суток - медленно окисляющих углеводороды.

Примечани е,- - отсутствие роста или регистрации результата.

Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано для бактериологического анализа природных сточных вод, а именно донных отложений. Целью изобретения является повышение точности способа. Способ заключается в фильтровании через мембранный фильтр пробы воды или разведений водной вытяжки из грунта, нанесении на фильтрующую поверхность фильтра тонкого слоя углеводорода или их смеси, размещении фильтра на пористой подложке, увлажненной минеральной средой, и культивировании при 20-21°С. Учет микроколоний на фильтре ведут под микроскопом после 2-3 и 5-6 суток культивирования, что позволяет дифференцированно учитывать бактерии, способные к активному и медленному окислению углеводородов. 1 табл.