СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОГО ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА В ПОЧВЕ Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/06 C12Q1/06 C12R1/645 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, фитопатологии, биотехнологии и может быть использовано для мониторинга за популяциями почвенных фитопатогенных грибов, а также при генетических исследованиях популяционной гетерогенности микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ.

Известна среда для определения зараженности почвы фитопатогенными грибами Fusarium culmorum (W.G.Sm) Sacc. с дифференциацией данного вида (А.с.СССР №969716, авторы А.В.Хотянович и др., 1982).

Однако эта среда не пригодна для определения заселенности почвы другими фитопатогенными грибами. Недостатком среды является сложность технологии приготовления, связанная с тем, что в нее для устранения нежелательной микрофлоры вводится целый комплекс дорогостоящих химических соединений (глицин, медицинская желчь и др.). Последнее существенно удорожает способ.

Известен способ непосредственного микрокопирования почвенных образцов, содержащих пропагулы исследуемого гриба, с применением иммунофлуоресцентного окрашивания объекта (Струнникова O.K. и др. Применение мембранных фильтров и иммунофлуоресцентного окрашивания для наблюдения за развитием почвообитающих микромипетов// журнал: Микология и фитопатология, 1998, т. 32, вып.2. С. 65-72; Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1989. С.7).

Способ иммунофлуоресцентной микроскопии находит ограниченное применение из-за необходимости работы с лабораторными животными в целях получения видоспецифичной сыворотки на грибы. К тому же отдельные структуры гриба трудно различимы из-за автофлуоресценции некоторых микроорганизмов и неспецифической адсорбции частицами почвы меченных флуорохромами антител. Таким образом, этот способ малодоступен, дорог и не всегда обладает высокой разрешающей способностью.

Более близким по техническому решению и достигаемому результату является способ изучения природных популяций грибов с применением их генетической маркировки (Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1989. С.24; Ф.К.Алимова и др. Кинетика Trichoderma harcianum Rifai Г-432 в тепличном грунте// журнал: Микология и фитопатология, 1996, т.30, вып.3. С. 48-54). В качестве маркера используют устойчивость грибов к определенному антибиотику. Отбор спонтанных мутантов, устойчивых к выбранному антибиотику, осуществляют в ходе пересевов на обычной для популяций питательной среде с последующим увеличением содержания антибиотика до такой концентрации, которая исключает рост других популяций.

Вместе с тем, в природном местообитании в процессе наблюдений за выбранной популяцией гриба могут регистрироваться другие микроорганизмы, способные с росту на используемой среде с антибиотиком. Многие антибиотики длительное время применяются в сельском хозяйстве, что приводит к появлению множества антибиотико-устойчивых форм микроорганизмов. Такие микроорганизмы способны совершенно подавить развитие на среде изучаемого объекта, так как многие из них обладают высокими радиальными скоростями роста колоний.

Таким образом, рассматриваемый способ не позволяет надежно отселектировать от посторонней микрофлоры внесенные в почву интродуценты, что искажает принцип единственного различия в эксперименте и снижает разрешающий потенциал способа. Точность учетов при этом способе невелика благодаря тому, что анализируются крупные морфологические единицы изучаемого объекта - колонии гриба, которые могут возникнуть как из одной пропагулы, так и из нескольких жизнеспособных пропагул, попавших в одну точку питательной среды при посеве. Число таких пропагул при данном способе учесть невозможно.

Целью предлагаемого изобретения является повышение надежности и точности учетов численности популяций почвенных фитопатогенных грибов для последующего управления ими и сдерживания популяционной плотности фигопатогенов на неопасном уровне.

Поставленная цель достигается тем, что питательные среды с высокой концентрацией антибиотика, засеянные почвенной суспензией, содержащей антибиотико-устойчивую популяцию гриба, выдерживают перед анализом при пониженной температуре в диапазоне от +1 до +5°С, а при подсчете численности объекта учитывают не колонии, а количество проросших спор. Совместное воздействие высокой концентрации антибиотика и пониженных температур позволяет надежно блокировать рост нежелательной почвенной микрофлоры, а регистрация под микроскопом пропагул объекта значительно увеличивает точность учетов.

Способ осуществляется следующим образом. В почву интродуцируется антибиотико-устойчивый штамм фитопатогенного гриба в виде конидий на шелухе ячменя, семенах проса и других подобных субстратах, либо в виде суспензии спор, полученной в результате смыва с сыпучей среды. Через определенные промежутки времени отбирают пробы почвы и готовят по стандартной микробиологической технологии серию разведений почвенной суспензии. Затем суспензию высевают по 1 мл определенного разведения в чашки Петри и заливают их тонким слоем расплавленной и охлажденной агаризованной среды Чапека (последняя является наиболее подходящей для культивирования большинства почвенных грибов). Перед заливкой в чашки в питательную среду вводят антибиотик, создавая его концентрацию порядка 1 мг/мл среды. После застывания агара в чашках Петри их инкубируют в термостате при температуре 22-25°С в течение 10-15 часов. За это время конидии антибиотико-устойчивого штамма гриба успевают прорасти и сформировать нормально развитые ростковые трубки. Затем чашки с посевами помещают в условия пониженных температур. Температуры порядка +1÷+5°С легко достигаются в камере обычного холодильника. В таких условиях рост любых мезофильных микроорганизмов приостанавливается. Высокая концентрация антибиотика в питательной среде позволяет элиминировать чувствительные формы грибов и бактерий в связи с различиями в норме реакции генотипов различных видов микроорганизмов, а пониженные температуры сдерживают рост сопутствующей микрофлоры, также хорошо адаптированной к антибиотику, как и изучаемый штамм гриба.

Помещенные в холодильную камеру чашки с посевами могут сохраняться там в течение 10-15 суток, при этом на поверхности агаризованной пластинки видимые невооруженным глазом колонии не появляются.

По мере необходимости чашки с посевами извлекают из холодильной камеры, согревают при комнатной температуре, помещают на столик микроскопа (предварительно сняв с чашки крышку) и при малом увеличении (50-70-кратном) просматривают дно чашки, регистрируя в агаровом слое жизнеспособные пропагулы изучаемого гриба. Регистрация проросших пропагул значительно повышает точность учетов численности объекта, так как под микроскопом хорошо отличимы споры, лежащие одиночно и расположенные в слое питательной среды рядом друг с другом (группами).

Пример. Культуру стрептомицинустойчивого штамма возбудителя корневой гнили злаков - гриба Bipolaris sorokiniana Shoem. в условиях лаборатории размножают на сыпучей питательной среде (автокдавированное пшено или другой субстрат). Полученный споровый материал вносят в почву. Через определенное время после интродукции гриба отбирают пробы почвы массой до 200 г в стерильные пакеты из крафт-бумаги. В лаборатории с соблюдением условий стерильности берут навеску почвы массой 10 г и помещают в колбу с 90 мл стерильной воды. Готовят серию разведений почвенной суспензии (10^-2, 10^-3). Стерильной пипеткой 1 мл суспензии из разведения 10^-3 вносят в чашку Петри (всего на 1 почвенный образец засевается 4 чашки) и заливают расплавленной и охлажденной до температуры +45°С питательной средой Чапека. Непосредственно перед розливом теплой среды по чашкам в нее вводят стрептомицин, доводя его концентрацию до 1 мг/мл среды.

При запивке чашек Петри питательную среду вносят в небольших количествах, добиваясь ее распределения по дну чашки как можно более тонким слоем.

После застывания агара чашки Петри с посевами помещают в термостат при температуре 22-25°С не более чем на 10-15 часов. Затем чашки с посевами переносят в холодильник, где они могут храниться при температуре от +1 до +5°С в течение 10-15 дней. По мере необходимости чашки вынимают из холодильника, дают им согреться при комнатной температуре, снимают крышку с чашки и помещают ее на столик микроскопа. Подсчет числа проросших конидий гриба выполняют при 50-70-кратном увеличении, микроскопируя все дно чашки Петри.

Полученные результаты представлены в таблице,

где отражены данные для одной и той же серии чашек. Сначала была проведена их инкубация в холодильнике и выполнен подсчет проросших спор гриба под микроскопом, затем чашки были помещены в термостат до момента появления хорошо развитых колоний.

Из таблицы видно, что подсчет спор под микроскопом дает более точное представление о численности гриба в образце почвы, тогда как учет колоний приводит к заниженным результатам. Кроме того, подсчет колоний сопряжен с трудностями, так как на чашках Петри после их пребывания в термостате появляется много быстрорастущих стрепгомицинустойчивых форм посторонних микроорганизмов, маскирующих и подавляющих развитие изучаемого объекта.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет надежно подавить нежелательную микрофлору при изучении популяций почвенных фитопагогенных грибов и повысить точность наблюдений.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, фитопатологии и биотехнологии. Способ включает посев почвенной суспензии на питательную среду с высоким содержанием антибиотика. Инкубирование проводят при 22-25°С с последующей выдержкой при 1-5°С. Число проросших спор учитывают визуально. Способ обеспечивает повышение точности и надежности учетов антибиотикоустойчивых популяций фитопатогенного гриба. 1 табл.

Способ количественного анализа антибиотикоустойчивого фитопатогенного гриба в почве, включающий посев почвенной суспензии на питательную среду с высоким содержанием антибиотика, инкубирование, визуальный количественный анализ, отличающийся тем, что инкубирование проводят при 22-25°С с последующей выдержкой при 1-5°С, а при визуальном количественном анализе учитывают число проросших спор.