Способ определения сортовой чистоты семян тыквенных культур Советский патент 1989 года по МПК A01C1/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в овощеводстве, селекции и семеноводстве овощных культур.

Цель изобретения - повышение разрешающей способности метода электрофореза белка тыквенных.

Пример 1. Пробу зрелых сухих семян тыквы массой 25 -мг (1/3-1/10 часть семени) измельчают в муку и обезжиривают 0,5 мл диэтилового эфира. Экстрагируют белковую фракцию 1 мл 5%-ного раствора хлорида натрия в течение 3 ч при 20°С. Экстракт центрифугируют при 100000 g в течение 5 fflн. Осаяодают белок из супернатанта добавлением 2 МП Н20 в течение ночи при 4°С и центрифугируют при 7000-10000 g в течение 5 мин. Растворяют осадок в 120 мкл буфера (0,125 М трнс-НС1; рН 6,8), 4% додецилсульфата натрия, 20% сахарозы, 5% А-меркаптоэтанола. Кипятят в течение 3 мин.

Электрофорез кукурбитина в полу- чанном растворе проводят в двуслойном геле: верхний (концентрируЕОЩий) содержит 5% акриламида, а нижний (разделяющий) 12,5%. В обоих гелях массо.

3149

вое отношение акриламида к N/N -мети- ленбисакрш1амиду составляет 29,2:0,8 Для приготовления гелей используют следующие растворы;

30%-ный акриламид: акриламид 29,2 г, N,N -метиленбисакриламид 0,8 г, ..объем доводят водой до 1UO мл

трис--НС1-буфер (рН 8,8): трис 18,2 г, додецилсульфат натрия 0,4 г, объем ДОВОДЯТ водой до 100 мл;

трис-ЫС буфер (рН 6,8): трис 6,0 г, додецилсульфат натрия 0,4 г, объем доводят водой до 100 мл;

тристлициновый буфер, рН 8,3: глицин 28,8 г, трис 6,06 г, додецил- сульфат натрия 2,0 г, объем доводит водой до 2л,

Концентрирующий гель состоит из 1,5 мл раствора акриламида, 2,5 мл трис -НС1-буфера, 6 мл бидистиллиро- ванной воды, 0,06 мт 10%-ного персульфата аммония, 0,01 мл N,N,,N(N тeтpaмeтилeндиaминJЭ.

Разделяющий гель состоит из 11,8м раствора акриламида, 8,75 мл трис- НС1 буфера, 14,2 мл бидистиллирован- ной воды, 0,18 мл 10%-ного персульфата аммония, 0,015 мл N,N.,N, N тетраметилендиамина. Размеры разде- ляющего геля составляют 180х140х (мм). Одновременно анализируют 32 образца, В качестве .электродного раствора использз ют трис-тлициновый буфер (раствор г). Образцы наносят в объеме 0,005-0,015 мл в каждую лунку. Электрофорез проводят при градиенте потенциала 13 В/см в течение 4,5 ч. После окончания электрофореза гель помещают в 15%-ьшй раствор три- хлоруксусной кислоты на 1 ч. В табл,1 представлены результаты электрофоре- тического разделения кукурбитина предлагаемым способом, а в табл,2 - результаты, полученные при различных граничных и промежуточных условиях.

ак следует из табл. 2, при выходе за пределы граничных значений интервалов параметров, включенных в формулу изобретения, эффект необхо ДИМОЙ разрешающей способности не достигается.

П р и м е р 2, Определение сортовой чистоты тыквы сорта Рекорд проводилось методом электрофореза кукур битина, вьщеленного из покоящихся семян, по методике, изложенной в примере 1. Для анализа было взято 100 семкн.

Предварительная работа с чистосортным материалом сорта Рекорд позволила выделить два характерных для сорта электрофоретических спектр кукурбитина, различающихся по аллелю компонента с молекулярной массой 25,4 кД.

В табл. 3 представлены компоненты электрофоретического спектра кукурбитина биотипов сорта Рекорд.

Анализ проведен для установления сортовой чистоты конкретной партии семян сорта электрофорети- ческим спектром кукурбитина с молекулярной массой субъединиц 21,9, 23,3, 23,9, 24,7 кД. Сортовая чистота, установленная таким способом, составляет 97% (по данным грунт-контроля 98%) .

Анализ этой же партии семян по известной методике не позволяет выделить примеси, равно как и биотипы в сорте Рекорд (табл. 4), Все исследованные образцы обладают единым спектром, что подтверждает более низкую разрешающую способность известной методики и невозможность ее использования в контроле сортовой чистоты тыквенных.

В табл. 4 представлены компоненты электрофоретического спектра кукурбитина сорта Рекорд по методике

VJ.Roller.

I

Предлагаемый способ позволяет проводить анализ по отдельно взятому семени, что необходимо для определения сортовой чистоты, сократить процесс экстракции кукурбитина практически на сутки, что значительно ускоряет анализ сортов.

Формула изобретения

Способ определения сортовой чистоты семян тыквенных культур по электро форетическому спектру белкл, включающий выделение кукурбитина из образца покоящихся семян, его восстановление до субъединиц,, электрофоретическое разделение субъединиц в двухслойном полиакриламидном геле на основе акриламида и N,N -метиленбисакриламида, один из слоев которого является концентрирующим, а другой - разделяющим, в- присутствии додецилсульфата натрия и проявление разделенных субъединиц, отличающийся тем, что, с целью повышения разрешающей способиостн, в качестве концентрирующего берут гель с содержанием акрнламида 4,9-5,1 мас.%, а в качестве разделяющего - гель с содержанием акриламида 11,9 - 12,1 мас.%, а соотношение акриламида к N JN -мeтиJleнбиcaкpи.I aмидy в геле устанавливают в интервалах 29,0-29,2:0,8-1,0 соответственно, причем разделение ведут при градиенте потенциала 13-14 В/см.

Таблица 1

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в овощеводстве, селекции и семеноводстве овощных культур. Цель изобретения - повышение разрешающей способности метода электрофореза белка тыквенных. Для этого берут концентрирующий гель с содержанием акриламида 11,9...12,1 мас.%, а соотношение акриламида к метиленбисакриламиду в геле устанавливают в интервалах 29,0...29,2:0,8...1,0 соответственно, причем разделение ведут при градиенте потенциала 13...14 В/см. В этом случае достигается более высокое разрешение, чем в известном способе. Выделяются три полиморфных зоны:А 48-51 кД, В 30-36 кД, С 21-26 кД. Деление кукурбитана осуществляется на 14-18 субъединиц, четко выражена сортовая и биостинная специфичность спектров, легко отличимы гибридные спектры редких гибридов. Повышение разрешающей способности позволяет с большей достоверностью анализировать сорта, различать сходные генатины, выбраковывать резкие рибриды.

++ ++

++

++

+

+

+ +

++

+ +

+ +

Примечание. 1-5 Cucurbita реро Грибовская кустовая.

Украинская многоплодная, Грибовская 37, Сотэ, Белая 13 6-7 Cucurbita Грибовская зимняя

maxima

8-9 Cucurbita mosckata

Мраморная Мускатная Перехватка

Режим

25

,7 I 25,4 Т 23,4 I 23,0 1 22,8 I 21,

ия е%:

я

Диф, комп.

+

+

+ +

++

++

+ +

f

+

+ +

+

+

+ + + +

+ + + +

+ + +

+

-ь +

+ +

Мраморная Мускатная Перехватка

Таблица2

Данные компонентов при мол.м. (кД)

+ + +

+

+ +

+ + +

+ +

+ + +

+

+ +

Режим

Данные компонентов при ,мол.м. (кД)

25,7 I 25,4 Т 23,4 Г 23,0 I 22,8 1 21,5

- +

+ + + +

- + + + + +

8,6 + 8,8 + 9,0

Соотношение акриламида к. метилв

бнсакрилаш1ЛУ

29:0,8 + - + + + + 29:1 - .)- - . + : + + +

29,2:0,8 + . + - + + + 29,2:1 - + -I- + + +

Градиент, по-

гёициала,.

В/см

13+ +, ..- +

12Диффуз11ые компоненты

ТаблицаЗ Биотип. Данные при мол.м.

21,9 I 23,3 1 23,9 Т 25,1 |25,4

1++++2.+++++

Таблица 4

Мол.м., Данные при содержании ком- кД понеНТОв

21,9 I 23,3 I 23,9 .25,1 + + + +

Составитель А.Проказин Редактор В.Бугренкова Техред М.Дидык Корректор М.Самборс ая

Заказ 4476/1Тираж 621 Подписное

ВНИНШ1 Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35,- Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Продолжение табл.2

- + + + + +