Способ определения антител к катехоламину Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к химии получения новых соединений для их использования в технике иммунохимических исследований.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа при определении титров антител к катехоламину.

Способ осуществляют следующим образом.

В раствор пероксидазы в воде добавляют катехолэмин и глутаровый альдегид в молярном соотношении компонентов 1:100:8-16 соответственно, смесь инкубируют при 20-30°С в течение 3 ч, после чего выделяют целевой продукт диализом против воды.

Возможен также вариант, при котором пероксидазу растворяют в воде, в раствор

добавляют перйодат натрия в количестве 150-200 М на 1 М пероксидазы, реакционную смесь инкубируют 30-40 мин, диализу ют против воды, после чего в ней растворяют катехоламин в количестве 200 М на 1 М пероксидазы, инкубируют при 20-30°С в течение 3 ч, а затем выделяют целевой продукт диализом против воды.

Для повышения чувствительности способа определения титров антител к катехоламину путем обработки иммобилизованного на твердой фазе комплекса антиген-антитело ферментсодержащим биологически активным веществом, взаимодействия с субстратной смесью и последующего определения титра антител по интенсивности окраски, твердую фазу сенсибилизируют вторыми антителами, их подО

ел (

ft

ся

вергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37°С в течение 40 мин, после чего твердую фазу промывают водой и к ней добавляют меченый пероксидазой катехоламин в разведении 1:100, реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37°С, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют титр антител.

Согласно способу определения катехо- ламинов, антитела к катехоламину сенсибилизируют на твердой фазе, затем к иммобилизованным антителам добавляют исследуемую пробу, инкубируют при 37°С в течение 40 мин, отмывают водой, после чего к образовавшемуся комплексу добавляют меченый пероксидазой катехоламин, инкубируют при 37°С в течение 40 мин, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют количество катехоламина в исследуемой пробе.

.По первому способу катехоламин связывается с пероксидазой при помощи бифункционального реагента - глутарового альдегида.

Пример 1. Получение меченого пероксидазой норадреналина 0,1 мкМ пе- роксидазы растворяют в 2 мл воды, добавляют в раствор 10 мкМ норадреналина и по каплям 2 мл раствора, содержащего 0.8 мкМ глутарового альдегида. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем подвергают диализу против воды на диализной мембране 20/32 фирмы Serva (ФРГ) в течение 24 ч.

Для сенсибилизации поверхности полистиролового планшета используют вторые антитела, в качестве которых применяют IgG морской свинки к IgG кролика, в концентрации 20 мкг/мл в 0,1 М карбонатбикарбо- натном буфере рН 9,6. В каждую лунку планшета вносят по 50 мкл раствора вторых антител и инкубируют в течение 18 ч при 4°С, после чего лунки промывают водой с добавлением твина-20 фирмы Ferak (Западный Берлин). Затем в каждую из лунок вносят антисыворотку к определяемому катехоламину в двукратных разведениях (по 50 мкл), начиная с разведения 1:200, инкубируют в течение 40 мин при 37°С, затем отмывают водой с твином- 20 и вносят в каждую из лунок по 50 мкл меченого пероксидазой катехоламина, вид которого соответствует определяемому типу антител, в разведении 1:100. Смесь инкубируют в течение 40 мин при 37°С, после чего планшеты отмывают водой с твином-20 и добавляют в каждую из лунок по 50 мкл субстратной смеси, состоящей из 5 мл раствора ортофенилендиамина (0,4 мг/мл) в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере рН 5,0 и 20 мкл 3%-ной перекиси водорода. После инкубации в течение 5 мин ферментативную реакцию останавливают 50%-ным раствором серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке регистрируют на многоканальном фотометре FP-901. фирмы Labsystems Oy (Финлян0 дня) при 500 нм.

По второму способу углеводную часть пероксидазы предварительно подвергают окислению перйодатом натрия и активированный таким образом фермент вступает в

5 реакцию с катехоламином.

Пример 2. Получение меченого пероксидазой норадреналина.

0.2 мкМ пероксидазы растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Затем к этому

0 раствору добавляют 0,2 мл раствора, содержащего 30 мкМ перйодата натрия, перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и диализуют против воды. 40 мкМ норадреналина раство5 ряют в 1 мл фосфатного буфера рН 7,2 и добавляют к раствору окисленной перйодатом пероксидазе. Смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре, а затем диализуют против воды на диализной

0 мембране 20/32 фирмы Serva (ФРГ) в течение 24 ч.

Определение титра антител проводят как в примере 1

Препарат, синтезированный по перво5 му способу, содержит большее количество катехоламина, присоединенного к пероксидазе (6-8 М на 1 М пероксидазы), чем препарат, полученный по второму способу (3-4 М на 1М пероксидазы). В то же время

0 препарат, полученный по второму способу, обладает большей ферментативной активностью ( М против 5- М). Из практических соображений предпочтение к использованию одного из препаратов от5 дать затруднительно, так как качественные параметры их примерно одинаковы. Отсюда следует, что первый и второй способы получения являются альтернативными.

0 Основным критерием оценки свойств полученных препаратов служит определение связывающей способности антител к катехоламинам по отношению к этим препаратам.

5 Для сравнения производят определение титров антител прототипным способом, при котором полист ироловыи планшет сенсибилизируют соответствующим катехоламином, а образовавшийся комплекс катехоламин - антитело индентифицируют

вторыми антителами, мечеными перокси- дазой. По данным измерения оптической плотности построены зависимости в координатах - оптическая плотность против фактора разведения антисыворотки: при определении известным способом и предлагаемым способом. В известном определении: при разведении антител 1:3200 и выше оптическая плотность не изменяется и равна 0,17. В предлагаемом определении это зна- чение оптической плотности достигается при разведении 1:891.200 и выше. Это говорит о том, что образовавшийся комплекс катехоламин-антитело выявляется в предлагаемом способе в 256 раз чувствительнее, чем в прототипном. Таким образом, применение меченого пероксидазой катехоламина в предлагаемой схеме определения титров позволяет повысить чувствительность определения более чем в 200 раз.

Формула изобретения 1. Способ определения антител к кате- холамину, включающий сенсибилизацию твердой подложки, добавление исследуе- мой сыворотки, ферментспецифического субстрата и определение количества антител по развитию специфического окрашивания, отличающийся тем. что, с целью увеличения чувствительности способа, твердую подложку сенсибилизируют вторичными, антителами и после добавления исследуемой сыворотки вносят ферментно- меченный катехолэмин. приготовленный путем его конъюгирования и инкубирования в течение 3 ч при комнатной температуре с последующим диализом.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем,- что при конъюгировании ферментно- меченного катехоламина используют ка- техоламин, пероксидазу хрена и глутаровый альдегид в молярном соотношении 1:100:8-16.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем. что перед коньюгированием фермент- но-меченного катехоламина пероксидаэу хрена активируют перйодатом натрия, взятых в молярном соотношении 1:150-200, выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и используют в соотношении с катехоламином 1:200.

Изобретение относится к химии получения новых соединений для их использования в технике иммунохимических иследований. Цель изобретения - повышение чувствительности к катехоламину. Для этого в раствор пероксидазы в воде добавляют катехоламин и глутаровый альдегид в молярном соотношении компонентов 1:100:(8-16). Смесь инкубируют при 20-30°С в течение 3 ч, затем выделяют целевой продукт диализом против воды. Для повышения чувствительности способа твердую фазу сенсибилизируют вторичными антителами, их подвергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37°С 40 мин, затем твердую фазу промывают водой, добавляют меченый пе- роксидазой катезоламин в разведении 1:100. Перед конъюгированием ферментно- меченого катезоламина пероксидазу хрена активируют периодатом натрия при молярном соотношении 1:(150-200), выдерживают 30-40 мин и используют в соотношении катехоламином 1:200. Реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37°С, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют титр антител. 2 з.п. ф-лы. fe