Способ получения иммунореагента для выявления антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции розеткообразования Советский патент 1991 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к биологии, медицине, а именно к приготовлению реагентов для иммунологических исследований.

Цель изобретения - повышение стабильности реагента, расширение спектра получаемых иммунореагентов и снижение гемолиза эритроцитов при сенсибилизации.

Пример 1 о Определение стабильности иммунореагенга.

i

Нативные эритроциты кур трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин 15 мин и ресуспендируют до 10%-пой концентрации забуференным фтиологи- ческим раствором (ЗФР),. Смеинвлют с равным объемом 14,4%-ным раствором ацетальдегида, содержащего 0,85% хлористого .чптрия. Смесь осторожно

перемешивают и выдерживают 24 ч при 37°С при периодическом осторожном перемешивании„ Фиксированные эритроциты трижды отмывают ЗФР центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в таком же растворе до 20%„ Фиксированные эритроциты нагружают тейхоевой кислотой (ТК) из клеточных стенок золотистого стафилококка в следующем режиме: смешивают равные объемы 20% взвеси эритроцитов, раствора ТК и 0,5% раствора хлорида хрома, смесь выдерживают 5-6 мин при комнатной температуре. Сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают ЗФР (рН 7,2), содержащим 0,02% бычьего сывороточного альбумина, центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 мин и ресуспендируют в таком же растворе до ЮХ-ной концентрации.

О 00

-U

N5

00 4

Иммунореагентн готовят в день постановки, за I поделю до постановки и па 12 нес до постановки реакции розеткообразовання (РГО)с

РРО ставят следующим образом О, 1 мл лимфоцитов от каждой из трех больных маститом смешивают с 0,1 мл 0,2%-ного иммунорсагснта, смесь выхлорида натрия 0,85%. Всего фиксируют 40 проб эритроцитов в условиях, различающихся хотя бы по одному параметру. Результаты оценивают по следующим показателям: гемолиз при фиксации; гемолиз при хранении; спонтанная агглютинация эритроцитов; спонтанное розеткообразование с

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунодиагностике.Цель изобретения - повышение стабильности реагента, расширение спектра получаемых иммунореагентов и снижение гемолиза эритроцитов при сенсибилизации„ Цель достигается фиксацией эритроцитов кур ацетальдегидом в конечной концентрации 7,2±0,05% в течение 24 ч при 37 ± 0,5°С„ (Л

15

30

дер/кивают 5 мин при 37°С, затем цент- ю лимфоцитами человека при использоварпфугируют 10 мин при 1000 об/мин и выдерживают дополнительно 1 ч при ч°С, Из осадка готовят мазок на предметном стекле, фиксируют его метанолом и окрашивают мети еловым синим. При :этом иммунореагеит сохраняет стабильность в течение 12 мес (срок наблюдения), ц то время как иммуно- реагеш , приготовленный на нативных эритроцитах кур, лизирует уже к седь- 20 мому дню после получения.

П р и м е i 2. Для оценки возможности получения иммунореагента при помошд различных приемов сенсибилизации фиксированные предлагаемым спо- 25 собом и нативные эритроциты кур нагружают различными бактериальными антигенами при использовании оптимальных для каждого антигена способов сенсибилизации: протейными и исевдо- монаднымп липополисахаридами без посредников; TIC -золотистого стафилококка и экзотоксином Л (ЭТА) сипегной- ной палочки при помощи хлорида хрома; солянокислыми экстрактами (C J) стафилококков , стафилококковым анатокси- ном и гидроконламиновыми антигенами (ГЛ) протест при ПОМОРШ амидола. Во всех случаях, когда иммунореагеит мог быть получен известным способом, он был получен и данным способом, при этом результаты П О с реагентами, полученными обоими способами, не различаются Когда оптимальным конъюги- руклчнм агентом был амидол, иммуноре- агепт известным способом получить было нельзя, а данным можно.

Пример 3. Куриные эритроциты отмывают, как описано в примере 1L После этого смешивают равные объемы 10% взвеси эритроцитов кур и фиксирующего раствора. Фиксацию .проводят при 20 и 37°Г в течение 12- 72 ч при концентрациях альдегида в фиксирующем смеси 14,4; 10,8; 7,2; 5,4; 3,6%, Кроме того, эритроциты кур (Ьпксируют формальдегидом По не ох случаях пП фньсир укгнеи спеси соетишяет /,2, -ч г i ;,каине н ней

35

40

45

50

55

нии ненагруженных эритроцитов. Дополнительно сравнивают пригодность эритроцитов связывать различные бактериальные антигены при применении различных методов сенсибилизации. Дня этого каждую отобранную пробу эритроцитов нагружают бактериальными антигенами при использовании оптимального метода сенсибилизации: СЭ эпидермального стафилококка и стафилококковым анатоксином - при помощи амидола., ЛПС синегнойной палочки - без посредников, ЭТА синегнойной палочки - при помощи хлорида хрома. Для каждого антигена и каждой пробы эритроцитов подбирают оптимальную сенсибилизирующую дозу. Уровень сенсибилизации проверяют в реакции пассивной гемагглютинации с гомологичными иммунными сыворотками.

Таким образом, оптимальными оказались следующие условия фиксации: содержание ацетальдегида в смеси 7,2± 0,05%, 24 ч 37±0,5°С.

При использовании фиксированных данным способом эритроцитов кур были приготовлены 4 стафилококковых, 8 псевдомонадных и 9 протейных им- мунореагентоВо Они используются в течение года и сохраняют свою стабиль ность о С их применением обследовано 102 больных с бактериологическим подтверждением диагноза„

Полученные данные демонстрируют высокую специфичность антигенсвязы- ваюших лимфоцитов с иммунореагентами, приготовленными по данному способу, обеспечивающему стабильность иммунореагента и возможность его получения оптимальным для каждого используемого антигена методом.

Формула изобретения

Способ получения иммунореагента для выявления антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции розеткообраэо- вания, включающий сенсибилизацию

5

0

0

5

5

0

5

0

5

нии ненагруженных эритроцитов. Дополнительно сравнивают пригодность эритроцитов связывать различные бактериальные антигены при применении различных методов сенсибилизации. Дня этого каждую отобранную пробу эритроцитов нагружают бактериальными антигенами при использовании оптимального метода сенсибилизации: СЭ эпидермального стафилококка и стафилококковым анатоксином - при помощи амидола., ЛПС синегнойной палочки - без посредников, ЭТА синегнойной палочки - при помощи хлорида хрома. Для каждого антигена и каждой пробы эритроцитов подбирают оптимальную сенсибилизирующую дозу. Уровень сенсибилизации проверяют в реакции пассивной гемагглютинации с гомологичными иммунными сыворотками.

Таким образом, оптимальными оказались следующие условия фиксации: содержание ацетальдегида в смеси 7,2± 0,05%, 24 ч 37±0,5°С.

При использовании фиксированных данным способом эритроцитов кур были приготовлены 4 стафилококковых, 8 псевдомонадных и 9 протейных им- мунореагентоВо Они используются в течение года и сохраняют свою стабильность о С их применением обследовано 102 больных с бактериологическим подтверждением диагноза„

Полученные данные демонстрируют высокую специфичность антигенсвязы- ваюших лимфоцитов с иммунореагентами, приготовленными по данному способу, обеспечивающему стабильность иммунореагента и возможность его получения оптимальным для каждого используемого антигена методом.

Формула изобретения

Способ получения иммунореагента для выявления антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции розеткообраэо- вания, включающий сенсибилизацию

51634284

эритроцитов кур антигеном, о т л и - лиза эритроцитов при сенсибилизации, чающийся тем, что, с целью перед сенсибилизацией эритроциты об- повышения стабильности реагента, рабатывают ацетальдегидом в конечной расширения спектра получаемых имму- концентрации 7,20±0,05% ь течение иореагентов, а также снижения гемо- 22-24 ч при 36,5-37,5°С„