Способ определения повышенной чувствительности организма к дрожжеподобным грибам Советский патент 1985 года по МПК A61K39/00 

сд Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики повышенной чувствительности к антиге нам, в частности к дрожжеподоёным грибам рода Кандида, Целью изобретения является повышение точности способа. Пример, Производят формалинизацию эритроцитов барана. Кровь отбирают в раствор Олсвера в отношении 1:1 и выдерживают при 4 С в течение 24 ч. Затем трижды отмывают 20 объемами забуференного физиологического раствора (ЗФР) рН 7,2 в течение 20 мин при и 1500 об/мин Из осадка готовят 8%-ную суспензию эритроцитов на ЗФР рН 7,2, к которой добавляют равный объем 3%-ного раствора формалина на ЗФР рН 7,2. Смесь переливают в плоскодонную колбу и ставят на магнитную мешалку на 18 ч при 37 С, после чего отмывают 6 раз 20 объемами ЗФР рН 7,2. Присутствие формалина контролируется реактивом Шиффа. Из осадка готовят 10%-ную взвесь эритроцитов на ЗФР рН 7,2, которая может храниться при 4 С в течение 4-5 мес. Подбор оптимальной дозы антигена для нагрузки эритроцитов проводят в серии предварительных опытов, за- ключающихся в инкубации формалинизированных эритроцитов с различными концентрациями кандидозного антигена. В ряд пробирок вносят по 1 мл раствора, состоящего из возрастающих количеств сухого антигена (0,5; 1-, 2-, 3$ 4 мг) в ЗФР рН 6,4, и добавляют 0,1 мл предварительно отмытых 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана. Смесь инкубируют 30 мин при 37с на водяной бане при периодическом встряхивании, быстро отмывают 2 раза при и 1500 об/ьда от несвязавшегося антигена ЗФР рН 6,4 с добавлением нормальной инак тивированной кроличьей сыворотки в разведении 1:100. Готовят 1%-ную взвесь эритроцитов в ЗФР рН 7,2. Про водят реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА) с сывороткой кролика, иммунизированного данным кандидозным антигеном по общепринятой методике, и устанавливают оптимальную дозу кандидозного антигена, равную 1 мг. Приготовленная 1%-ная взвесь формали низированных эритроцитов барана. сенсибилизированных кандидозным антигеном в концентрации 1 мг/мл, может храниться прц 4 с в течение 4-5 мес при неизменной активности что было установлено опытным путем. У обследуемого из вены отбирают 3 мл крови в гепарин (из расчета 25 ед. на 1 мл крови), добавляют 3 мл среды 199, осторожно наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (d 1,077) и центрифугируют 30 мин при 400 , Образовавшееся на границе среды и градиента плотности кольцо лимфоцитов отсасывают пастеровской пипеткой, суспензию клеток отмывают 2 раза средой 199 в течение 10 мин при 1000 об/мин. К осадку добавляют 1 мл среды 199, осторожно ресуспензируют и подсчитьшают количество выделенных лимфоцитов в камере Горяева при окраске генцианвиолетом (0,05%-ный раствор на 3%-ном растворе уксусной кислоты) общепринятым методом. Доводят концентрацию лимфоцитов до 2л 10 в 1 мл средой 199. К 0,1 мл суспензии лимфоцитов добавляют 0,1 мл приготовленных сенсибилизированных эритроцитов, инкубируют 30-35 мин при 36-37 С, затем осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, Фиксирзпот образовавшиеся розетки 0,05 мл 0,06%ного раствора глютаральдегида в течение 20 мин при комнатной температуре. Для прерывания фиксации приливают 1 мл дистиллированной воды, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок острожно ресуспензируют, на обезжиренном стекле пастеровской пипеткой приготавливают препараты, которые окрашивают по ПаппенгеймуКрюкову, Микроскопию проводят с иммерсией, просчитьгоают 200 лимфоцитов, среди которых определяют процент клеток, присоединивших три и более эритроцита. Абсолютное количество РОК в 1 мкл крови опреде.ляют, исходя из количества лейкоцитов и числа лимфоцитов, найденных при подсчете лейкоцитарной формулы. Контроль ставят с 1%-ной взвесью фор-малинизированных эритроцитов барана без антигена. Реакцию считают положительной при наличии 20% и более РОК, Способ апробирован при обследовании 298 человек, имеющих контакт

с дрожжеподобными грибами рода Кандида в условиях производства. Контрольную группу составили 53 практически здоровых чел.овека, не имеющих контакта с указанными грибами.

У лиц контрольной группы содержание РОК составило 12,2±0,6%. При- нимая за норму колебание показателя в пределах M±1,5Gr, реакцию считают положительной при наличии 20% и более РОК. В контрольной группе положительный результат обнаружен в 9,4% лиц. Достаточно высокое со держание РОК и частота повьшенной чувствительности к грибам рода Кандида у лиц контрольной группы связаны по-видимому, с широким распространением указанных грибов в природе и наличием общих антигенных детерминант у представителей разных видов.

Повышенная чувствительность к кандидозному антигену обнаружена У 28,8% обследованных, контактирующих с дрожжеподобными грибами. Раз1784514

личия между 1 руппами установлены и при сравнении средних величин количества РОК как в относительных, так и в абсолютных показателях. 5 Полученные данные свидетельствуют о, наличии специфической сенсибилизации у лиц, имеющих производственный контакт с грибами рода Кандида, которая в 3 раза превышает

10 уровень таковой у лиц контрольной группы, что позволяет судить о чувствительности и специфичности ме-Еода выявления клеточной гиперчувствительности.

J5 Проведено сравнение предлагаемого способа диагностики клеточной гиперчувствительности in vitro с тестами, выявляющими гуморальную гиперчувствительность к дрожжеподобным грибам

20 РОД Кандида у контактирующих с ними. Положительная реакция розеткообразования обнаружена не только у лиц с положительными, но и у лиц с отрицательными гуморальными тестами.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЫШЕН-. НОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗЙА. К : ДРОМЕПОДОБНЫМ ГРИБАМ путем исследования крови, оо-личающийс я тем, что, с целью повышения точности способа из исследуемой крови вьщеляют лейкоциты и инкубируют их с эритроцитами барана, сенсибилизированными Candida gniliiermondii в течение 30-35 мин при 36-37% при этом антиген для сенсибилизации эритроцитов добавляют в дозе 0,54 мг/мл. S