Способ определения кардиотропной активности веществ Советский патент 1991 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и фармакологии.

Цель изобретения - повышение информативности за счет генеза активности.

Способ осуществляют следующим образом.

Для исследования берут морских свинок обоего пола весом 200-400 г. Животных забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и помещают в охлажденный (6 ±2°С) физиологический раствор для прекращения сердцебиений. После остановки сердца разрезают стенку правого желудочка и выделяют папиллярную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную пер- фузионную камеру объемом 0,6 мл. Сократительную функцию папиллярной мышцы изучают в изометрическом режиме. Для этого сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со штырем механотрона а второй конец закрепляют, например, зажимом, соединенным со стенкой перфузион- ной камеры. Первоначальную силу натяжения мышцы устанавливают 0,5 г.

Перфузию проводят со скоростью 6 мл/мин при 24-26°С раствором следующего состава, в мМ: NaC1120; KCI 4,8; CaClz 2,0, MgCl2 1,2; KH2PO/i 1,2; МаНСОз 25; глюкоза 10. Раствор насыщают газовой смесью 95%- ного 02 и 5%-ного С02. рН раствора после насыщения составляет 7.4 ±0,05.

Мышца сокращается под влиянием электрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15-20%, длительностью 5 мс, с частотой 0,5 гЦ. Длительность периода адаптации - 60 мин. В конце этого периода силу натяжения папиллярной мышцы увелиО

со

;СЛ

СА .W

ЧИВЗЮТ ДО (JrHLMflb MJb(. Л1 ОН 1 Н/1М ( И

крайними и чту гц/1/ но1Ч)| ,-ч.п , подцер ч оают до комЦ 1 огп i гч

После окончания ч ип сЛ м л п m р | - i онный расгпор оно nmviu ii i цииЗ Ю М

ПОСЛО Cl Т (ЛИ п. И li 1 i x ill

сокращения ч плрлпс тг,1 e нгРПЭИ I JJOIM водной эти кривые регистрируют За ем в перфузиончыи ррстпор виодят определенную концентрацию ис 1Гги г р лд После ттб||Л п | «р ,o: щения м параметров . нормой пр апнол ной эти кривые поьи.р) о ,п i ируюг

Из /301 г п1 ных г i i. t n первой ппоизвсдноп V г I°IMH пн

ПИЛЛЯрНОЙ ИЬ ШЦМ 1Г 0Г О оСк Ч ОГрСД.. ЛЯЮТ МЗКГИМГЛЬН,/ ОПОСТ iijj ijj M1ri

напрпже лч м нииь поем /Р Г ПЧСЧИЧ L,

ПерфуЗИОННЫИ рРГтВОр МСГ/l tls М ЭГЛ В Ч jt СТВЭ, МЧКСИМТ|1 iHyiO С ОООСГЬ ПОЗЫШПНЧ

напряжения до добтвлрьпг п ный раствор наследуемого oi iccrc-1 MV отношение т г прирост i копости 1ппрсЬчС ния, а млксимаш ну схорость рас слабления мышцы ппспе добавления tj перфузионныи оастр 1 nc icv enoro UPIHO ства, максимальную г ( про и , до добавления в nui пл гв следуемого вещества я«. tr Р прирост скорости paccrntmt г.и р сп р по 1 рост скорости напряжен п п ,vrc i л( ш- больше 10ч первый пень п огорою гс определяют положи релинчи пнптр пньи- эффект используемой кон слгрсч и i -чи ства связанныисактивациь Пчода i I bUi i в миоплазму в ходе сердечного цикл зчере сарколемму и из саркоплазм пического peri кулума, но в большей степет через cap колемму

Если приросг скорости напряжения г расслабления больше 1 0 и перпьм второго, то определяют по южмтольнпи иногропный эффект псполоз /е / ои концеш рации вещества связанный лкгизсщирп входа кальция в миоплазму в ходе сердечно го цикла через сарколемму и из гаркоплпз магического ретикулумо но п больше , степени - из саркопля матч per л ума

РСЛИ ПОИрО СкОрОСТИ чаПрЧЖО Ч1Я

меньше 1 0 а приросг сгоро ри расслаоло- ния больше 1,0 то определяют положительный инотропныи используемой концентрации еешетва связанный с уве личением кальция j мчоплэзму oxoqe сердечною цикля череч сагжплемг у при од новременном гни/сении ею чыПцосл чзгчр коплаэматичегкого ротикупума

/in прирост скорости напряжения и

тбленип меньше 1 0 и первый больше

торого го определяют отрицательный иноrnonniin аффект используемой концентра..ии п щртвс1 связанный со снижением поС|/плгния ионов кальция в миоплазму в оде сердечного цикла через сарколемму и П сагл оплатматического ретикулума, но в нолыи MI степени - через сарколемму

0

Ее/in прирост скорости напряжения и рпгглабленич меньше 1 0 и первый меньше п горого, го определяют отрицательный ино- фппныи эффект используемой концентра-j ним ne i;ecTBj связанный го снижением i ч т/пломчп 1 тнов кальция в миоплазму че- р°з гфколемпу и из саркоплазмртического ч чо ti большей степени - из сар- t чплаз 1оТ,1ческого ретикулума

чFfju1 прироп скорости сокращения и

ccJlaблвнп мышцы 1,0, то определяю что исследуемое вещество в использу- гмои концентрации на миокард не пгис iпурт

1М р и м е р 1 Для исследования берут

10оскую свинку весом 250 г Животное загншают ударом по голове Сердце быстро

страндартным способом и по1 iaio в о лтжденныи (6 ± 2°С) физио|Т-1,, |гскии раствор до прекращения г рдце тчг-нии После остановки сердца разрезаю1 г грнку правого желудочка и выделя- пт гппнллярную мышцу

Выделенную папиллярную мышцу

} помещают в термостатированную пер0знойную камеру объемом 0,6 мл Сокра- тнгс Ы /ю функцию папиллярной мышцы итучлю г в изог/етрическом режиме Для это- о сухожильный конец мышцы при помощи

итки соединяют со штырем механотрона

hiit 6MXIC а второй конец закрепляют зачпмом соединенным со стенкой перфузионнои камеры Первоначальную силу

натяжения мышцы устанавливают 0,5 г

LiПспфузию проводят со скоростью

1vi/ tnii при 25°С раствором следующего лсгава а мМ NaCI 120, KCI 4,8, CaCte 2,0,

4gCI2 1 2 1,2, NaYC0325, глюкоза 41 Раствор насыщают газовой смесью 95%( но,о О; и 5%-ного С02, рН раствора после .чслццения составляет 7,4 ± 0,05

Мышца сокращается под влиянием ) IPGKOH стимуляции прямоугольными импульсами величиной больше порого пои на 1Ь-20%, длительность 5 мс, с частотой 0,5 гЦ Длительность периода адаптации - 60 мин. В конце этого периода силу натяжения папиллярной мышцы увеличиваю до развития максимальной силы сокращения и эгу силу натяжения поддержи вают до конца опыта.

После окончания периода адаптации в перфузионный раствор вводят изадрин в концентрации 3-108 М. После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют. Затем дополнительно вводят изадрин. После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют.

Из документальных записей первой производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют максимальную скорость повышения силы сокращения после повышения в перфузи- онном растворе концентрации изадрина (14,6 г/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до повышения в пер- фузионном растворе концентрации изадрина (10,6 г/с), их отношение (1,38), а также максимальную скорость расслабления после повышения в перфузчонном растворе концентрации изадринз (17,7 г/с), максимальную скорость расслабления до повышения в перфузионном растворе концентрации изадрина (6,3 г/с), их отношение (2,81).

В данном примере при повышении концентрации изадрина значения прироста скорости сокращения и расслабления больше 1,0 и первый меньше второго Исходя из этих результатов определяют положительный инотропный эффект повышения концентрации изадрина, связанный с активацией входа кальция в миоплазму в ходе сердечного цикла через сарколемму и из саркоплазматического ретикулумэ, но в большей степени - через сарколемму. Это заключение соответствует имеющимся представлениям о механизме действия аго- нистов /8 -адренорецепторов, вызывающих повышение входа кальция в кардиомиоциты по медленным кальциевым каналам.

Исходная кривая силы сокращения папиллярной мышцы не имеет выраженной двухкомпонентной структуры и, следовательно, не может быть использована для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в прототипе.

Пример 2. Для исследования берут морскую свинку весом 300 г. Животное забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и помещают в охлажденный (6 ± 2°С) физиологический раствор до прекращения сердцебиений. После остановки сердца разрезают стенку правого желудочка и выделя-- ют папиллярную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную перфузионную камеру объемом 0.6 мл. Сократительную функцию папиллярной мышцы изучают в изотермическом режиме. Для этого сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со штырем механотрона

типа 6MXIC, а второй конец закрепляют зажимом, соединенным со стенкой перфузи- онной камеры. Первоначальную силу натяжения мышцы устанавливают 0,5 г. -Перфузию проводят со скоростью

6 мл/мин при 24°С раствором следующего состава, в мМ: NaC 120; KCI 4,8; CaCl2 2,0; MgCl2 1,2; КН2РСм 1,2; МаНСОз 25; глюкоза 10. Раствор насыщают газовой смесью 95%- ного 02 и 5%-ного СО2, рН раствора после

насыщения составляет 7,4 ± 0,05.

Мышца сокращается под влиянием электрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15-20%, длительностью 5 мс, с

частотой 0,5 Гц. Длительность периода адаптации - 60 мин. В конце этого периода силу натяжения папиллярной мышцы увеличивают до развития максимальной силы сокращения и эту силу натяжения

поддерживают до конца опыта.

После окончания периода адаптации в перфузионный раствор вводят изадрин в концентрации 3 10 Ми эту концентрацию сохраняют до конца опыта. После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют. Затем в перфузионный раствор добавляют оуабаин в концентрации . После стабилизэции.амплитуды силы

сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют. Из документальных записей первой производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют

максимальную скорость повышения силы сокращения после добавления в перфузионный раствор оуабаина (10,4 г/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до добавления в перфузионный раствор

оуабаина (4,1 г/с), их отношение (2,51), а также максимальную скорость расслабления после добавления в перфузионный раствор оуабаина (9,7 г/с), максимальную скорость расслабления до добавления в

перфузионный раствор оуабаина (4,0 г/с), их отношение (2,42).

В данном примере после добавления в перфузионный раствор оуабаина прирост скорости напряжения и расслабления больше 1,0 и первый больше второго. Исходя из этих результатов определяют положительный инотропный эффект добавления о пер- фуэионный раствор оуабаина, связанный с активацией входа кальция в миоплязму о ходе сердечного цикла через сарколемму и из саркоплазматического ротикулума, но в большей степени - из саркоплаэматичвско- го ретикулума,

Это заключение соответствует имею- щимся представлениям о механизме действия сердечных гликоэидов, увеличивающих вход кальция через сарколемму путем на- трий-кольциевого обмена.

Исходная кривая силы сокращения па- пиллярной мышцы не имеет выраженной двухкомпонентной структуры и, следовательно, не может быть .использована для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в про- тотипе.

Пример 3. Для исследования берут морскую свинку весом 280 г. Животное забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и по- мещают в охлажденный (6 ±2°С) физиологический раствор до прекращения сердцебиений. После остановки сердца разрезают стенку правого желудочка и выделяют папиллярную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную мер фузионную камеру объемом 0,6 мл. Сократительную функцию папиллярной мышцы изучают в изометрическом режиме. Для это- го сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со штырем механотрона типа 6MXIC, а второй конец закрепляют зажимом, соединенным со стенкой перфузи- онной камеры. Первоначальную силу натяжения папиллярной мышцы устанавливают 0,5 г.

Перфузию проводят со скоростью 6 мл/мин при 26°С раствором следующего состава, в мМ: NiCI 120; KCI 4,8; CaCl2 2,0; MgCl2 1,2; 1,2; №НСОз25; глюкоза 10. Раствор насыщают газовой смесью 95%- ного 02 и 5%-ного С02, рН раствора после насыщения составляет 7,4 ± 0.05.

Мышца сокращается под влиянием электрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15-20%, длительностью 5 мс, с частотой 0,5 Гц. Длительность периода адаптации - 60 мин. В конце этого периода силу натяжения папиллярной мышцы увеличивают до развития максимальной силы сокращения и эту силу натяжения поддерживают до конца опыта.

После окончания периода адаптации в пг рфуэионный раствор вводят изадрин в концентрации M и эту концентрацию сохраняют до конца опыта. После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют, Затем в перфузионный раствор добавляют верапамил а концентрации 10 J M, После стабилизации силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют. Из документальных записей первой производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют максимальную скорость повышения силы сокращения после добавления в перфузионный раствор вера- памила (3,3 г/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до добавления в перфузионный раствор верапамила (6,6 г/с), их отношение (0,49), а также максимальную скорость расслабления после добавления в перфузионный раствор верапамила(3,3 г/с), максимальную скорость расслабления до добавления в перфузионный раствор верапамила (10 г/с), их отношение (0,33).

В данном примере после добавления в перфузионный раствор верапамила прирост скорости сокращения и расслабления мьс.нцы меньше 1,0 и первый больше второго. Исходя их этих результатов определяют отрицательный инотропный эффект добавления в перфузионный раствор верапамила, сляпанный со снижением поступления ионов кальция в миоплазму в ходе сердечного цикла через сарколемму и из саркоплазматического ретикулума, но в большей степени - через сарколемму.

Это заключение соответствует имеющимся представлениям о механизме действия блокаторов входа кальция, снижающих вход этого катиона по медленным кальциевым каналам.

Исходная кривая силы сокращения папиллярной мышцы имеет недостаточно выраженную двухкомпонентную структуру, что затрудняет ее использование для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в прототипе.

Пример 4. Для исследования берут морскую свинку весом 290 г. Животное забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и помещают в охлажденный (6 ± 2°С) физиологический раствор до прекращения сердцебиений. После остановки сердца разрезают стенку правого желудочка и выделяют папиллярную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную перфу- зионную камеру объемом 0,6 мл. Сократительную функцию папиллярной мышцы изучают в изометрическом режиме. Для это- го сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со штырем механотрона типа 6MXIC, а второй конец закрепляют зажимом, соединенным со стенкой перфузи- онной камеры. Первоначальную силу натяжения папиллярной мышцы устанавливают 0,5 г.

Перфузию проводят со скоростью 6 мл/мин при 24°С раствором следующего состава, в мМ: NaCI 120; КС 4,8, CaCl2 2,0; MgCl2 1,2; КН2Р04 1,2; №НСОз25; глюкоза 10. Раствор насыщают газовой смесью 95%- ного 02 и 5%-ного , рН раствора после насыщения составляет 7,4 ± 0,05.

Мышца сокращается под влиянием элекрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15-20%. длительностью 5 мс, с частотой 0,5 Гц. Длительность периода адаптации - 60 мин. В конце этого периода силу натяже- ния папиллярной мышцы увеличивают до развития максимальной силы сокращения и эту силу натяжения поддерживают до конца опыта.

После окончания периода адаптации в перфузиониый раствор вводят изадрин в концентрации 3 10 Ми эту концентрацию сохраняют до конца опыта. После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют. Затем в перфузионный раствор добавляют кофеин в концентрации 610 М. После стабилизации силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют.

Из документальных записей первой производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют максимальную скорость повышения силы сокращения после добавления в перфузион- ный раствор кофеина (4,2 г/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до добавления в перфузионный раствор ко- фиена (5,4 г/с), их отношение (0,79), а также максимальную скорость расслабления по- еле добавления в перфузионный раствор кофеина (9,8 г/), максимальную скорость расслабления до добавления в перфузионный раствор кофеина (7,5 г/с), их отношение (р-1,31).

В данном примере после добавления в перфузионный раствор кофеина прирост скорости напряжения.меныие1,0,а скорости расслабления больше 1.0. Исходя из этих

результатов определяют положительный инотропный эффект добавления в перфузионный раствор кофеина, связанный с увеличением входа кальция в миоплазму в ходе сердечного цикла через сарколемму при одновременном снижении его выброса из сар- коплазматического ретикулума.

Это заключение соответствует имеющимся представлениям о механизме действия кофеина, являющегося ингибитором фосфо- диэстеразы и одновременно обедняющего саркоплазматический ретикулум кальцием.

Исходная кривая силы сокращения папиллярной мышцы имеет достаточно хорошо выраженную дву/компонентную структуру, но под действием кофеина первый компонент исчезает, сердечный цикл заметно удлиняется, что делает невозможным использование кривой силы сокращения для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в прототипе.

Применение предлагаемого способа позволяет (в отличие от способа-прототипа) определить механизм действия вещества на миокард за счет оценки влияния вещества на потоки кальция в миоплазму.

U n

Формула изобретения Способ определения кардиотропной активности веществ путем регистрации сокращения капиллярной мышцы экспериментального животного до и после воздействия исследуемого вещества, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности за счет оценки генеза активности, капиллярную мышцу извлекают, помещают в питательный раствор с температурой , в который добавляют 3 М изадрина, затем проводят стимуляцию мышцы с частотой 0,5 Гц и определение ведут по максимальной скорости повышения напряжения и расслабления мышцы, затем рассчитывают прирост скорости напряжения и прирост скорости расслабления мышцы отношением этих показателей, в случае если прирост скорости напряжения и расслабления мышцы больше единицы и в случае, если прирост скорости напряжения больше прироста скорости расслабления, определяют положительный инотропный эффект за счет увеличения выброса кальция из саркоспаз- матического ретикулума,в случае, если прирост скорости напряжения меньше прироста скорости расслабления,определяют отрицательный анотропный эффект за счет увеличения входа кальция через сарко- лему, если исследуемый показатель меньше 1,0 при приросте скорости напряжения

11 163513312

больше прироста скорости расслабления зажения меньше ,0, а прирост скорости рас- смет снижения входа кальция, если приростслабления больше 1.0 определяют положи- скорости напряжения меньше приростательный инотропный эффект вещества скорости расслабления за счет сниженияпутем снижения выброса кальция из cap- выброса кальция из саркоплазматического5 коплаэматического ретикулума и увеличе- ретикулума, если прирост скорости напря-ния входа кальция через сарколемму.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и фармакологии. Цель изобретения - повышение информативности за счет оценки генеза активности. Для этого капиллярную мышцу извлекают. помещают в пита-эльный раствор с температурой 24-26°С, в который добавляют 3 10 8-3-107 М изадрина. Затем проводят стимуляцию мышцы с частотой 0,5 Гц. После этого определяют максимальную скорость напряжения и расслабления мышцы до и после введения препарата. После этого находят прирост скорости напряжения и скорости расслабления мышцы после введения исследуемого вещества. В зависимости от сооношения полученных данных судят о механизме действия вещества на миокард. Применение способа позволяет, в отличие от прототипа, определять механизм действия вещества на миокард за счет оценки влияния вещества на потоки кальция в миоплазму. Ё