Способ получения авидина Советский патент 1991 года по МПК C07K3/02 C07K3/28 A61K37/02 

1

(21)4691749/04

(22)15.05.89

(46) 23.04.91. Бюл. № 15

(71)Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, Научно-производственное объединение Биолар АН СССР и МГУ им. М.В.Ломоносова

(72)И.К.Залите, Э.А.Арене, A.M.Шустер, А.Г.Габибов, А.-Г.Рабинков и В.И.Березин

(53)547.964.4.07 (088.8)

(56)Grun N.M., Tomas E.I. Puritica- tion and crystallization of avidin - Biochem. I. 1970, 118, c. 67-70.

(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВИДИНА

(57)Изобретение касается гликопро- теидов, в частности получения ави- дина (тетрамера гликопротеида с мол.м. 67000), применяемого в медици-

не. Цель - повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса,- Последний ведут гомогенизацией яичного белка с последующими осаждением гомо- генизата с помощью сульфата аммония в диапазоне концентраций 40-100% насыщения, растворением осадка в воде, повторным осаждением с помощью полярного органического растворителя при конечной концентрации последнего 40- 75%, экстракцией из осадка авидина кислым буферным раствором при рН 1- .6 хроматографированием экстракта на колонке с КМ-целлюлозой, элюировани- ем, диализом и выделением целевого авидина. Выход 94%, удельная активность 15,4 ед/мг, электрофоретичес- кая чистота 99,3%. Эти условия сокращают стадийность процесса с 10 до 5. 2 табл.

С/

С

Изобретение относится к способу получения авидина - биологически активного соединения, который находит применение в медицине, химической, микробиологической и пищевой промыш- ленности.

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение выхода.

Пример 1, Все операции, кроме осаздения органическим растворителем, проводят при комнатной темпер ат- туре (18725°С). На стадии фрикциони- рования сульфатом аммония к 50 л свежего яичного белка добавляют 20 л де- нонизированной воды (соотношение 5:2), гомогенизируют и к раствору при перемешивании постепенно добавляют 30 кг сульфата аммония (65% насыщения) и перемешивают до полного его растворения. Осадок отделяют центрифугированием (1200g, 20 мин) и отбрасывают. К 56 л супернатанта при перемешивании постепенно добавляют сульфат аммония до полного насыщения раствора (около 10 кг). Осадок собирают центрифугированием, супернатант отбрасывают.

На стадии осаждения полярным органическим растворителем осадок, содержащий авидин, растворяют в деиони- зированной воде и разбавляют до оптической плотности раствора ГО-15 опт.ед/млн при 280 нм. Раствор

С О О Ј

Ј

белка перед добавлением оаствооителя охлаждается до температуры от -2 до (смесь сухого льда с ацетоном или смесь льда с поваренной солью). Органический растворитель добавляют охлажденным до температуры -30 до -50°С (низкотемпературный холодильник или жидкий азот, или смесь сухого льда с ацетоном) при перемешива- нии небольшими порциями, Температура смеси поддерживается в пределах 2- 10°С.

К 4 л охлажденного раствора белка добавляют 6 л этилового спирта. После добавления всего количества спирта перемешивание продолжают 10-15 мин, после чего суспензию центрифугируют (I200g, 20 мин).

На стадии экстракции авидина из осадка после центрифугирования осадок объединяют и суспендируют с помощью гомогенизатора в 600 мл буфера 0,1 М глицин/HCl, рН 2,0 и перемешивают в течение 30 мин, Супернатант отделяют центрифугированием (l200g, 20 мин), осадок экстрагируют еще в 50.0 мл того же буфера. Осветленные экстракты объединяют. рН раствора доводят до 6,8 (конц, ).

На стадии хроматографии на КМ™ целлюлозе экстракт наносят на хрома- тографическую колонку с КМ-целлюлозой ( см), уравновешенной в буфере 0,05 М ацетат аммония, рН 6,8, после чего через колонку пропускают 0,05 М ацетат аммония, рН 9,0 (2л) и 0,3% карбонат аммония (2л) со скоростью потока через колонку 500 мл/ч Авидин элюируют ступенчатым града ен- том концентрацией 0,4-3,0% карбоната аммония (в каждой ступеньке концентрация карбоната аммония увеличивает- ся на 0,1%), Элюат детектируют при 280 им, фракции тестируют измерением активности авидина в них. Фракции, содержащие авидин, объединяют.

На стадии выделения целевого продукта, раствор авидина диализуют против деионизованной воды до удаления солей и высушивают из замороженного состояния.

0

д с

Q

5

- Весь цикл выделения осуществляет ся в течение 6 рабочих дней. Выход препарата 94%, удельная активность 15,4 ед./мг, электрофоретическая чистота 99,3%, соотношение Ай8о/Авбо равно 1,78,

Процесс очистки авидина характеризуется данными в табл. 1, где приведено выделение авидина на 5Q л яичного белка.

Примеры 2т9. Обрабатывают 5 л яичного белка,iмасштаб по сравнению с примером 1 1:10. Операция го- . могенизации яичного белка, фракционирования сульфатом аммония, осаждения органическим растворителем, хроматографии на КМ-целлюлозе и выделения целевого продукта проводят как в примере 1.

В табл. 2 представлены численные значения концентраций солей, растворителей, рН экстрагента и качественные показатели процесса и целевого продукта после лиофильного высушивания.

Предлагаемый способ позволяет получить авидин из яичного белка по упрощенной схеме, количество стадий сокращено в 2 раза (с 10 до 5), с выходом на 15-20% выше.

Формула изобретения

Способ получения авидина из яичного белка, включающий гомогенизацию яичного белка, хроматографию содержащего авидин раствора на КМ-целлюлозе с последующей элюацией, диализом и выделением целевого продукта путем лио- филизации, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличение выхода, гомогенизат осаждают сульфатом аммония в диапазоне концентраций 40-100% насыщения, осадок растворяют в воде, повторно осаждают добавлением полярного органического растворителя при конечной концентрации последнего 40-75% и авидин экстрагируют из осадка кислым буферным раствором при рН 1,0-6,0, экстракт хроматографируют на колонке с . КМ-целлюлозой о

Таблица